第六章


第六章 化学毒物的一般毒性作用
一般毒性作用(general toxicity effect): 是全身各系统对外源化学物的毒作用反应,又 称基础毒性(basic toxicity)。 根据接触毒物的时间长短分为:急性毒性、 亚慢性毒性和慢性毒性。

毒性效应
化学物的理化特性 一 般 毒 性 毒性大小和特征 急性毒性试验 蓄积毒性试验 亚急性毒性试验 亚慢性毒性试验 确定阈剂量和阈下剂量 慢性毒性试验

在体内的蓄积和耐受特性

毒性效应

毒作用的靶点和敏感指标

特殊毒性

生殖毒性、致突变、致癌和免疫毒性等

第一节 急性毒性作用及其评价
?一、概念
? 急性毒性:机体一次或24h内多次接触

外源化学物后所引起的快速剧烈的中毒效
应,包括一般行为、外观及形态改变,甚

至死亡效应。

? ? ?

实际工作中,机体接触化学毒物的方式或途径不 同,急性接触的含义也有所不同。 一次接触是指瞬间给实验动物染毒,如经口染毒、 经注射途径染毒。 经呼吸道与经皮肤染毒而言,则是指在一个特定 的期间使实验动物持续地接触化学物的过程。当化学 物毒性很低,需要给予动物较大剂量时,可在24小时 内分多次给予,这时的急性接触即为“多次” ,一 般不超过三次。

? ?

急性毒性效应一般是指机体接触化学物后,在较短时间内观 察到的毒性症状。 有的化学毒物在实验动物接触几分钟内即可产生严重中毒症 状,甚至瞬间死亡;而有些化学毒物几天、十几天后动物才产生

明显的中毒症状和死亡,呈现迟发毒效应。
? 有的化学毒物在出现快速和剧烈的毒效应后很快恢复;有的 化学物早期仅有较轻微症状, 几天后又出现严重中毒症状甚至死 亡。 ? 在实际工作中,大部分毒物的急性毒性症状在短期内出现, 一般为7~14天。

急性指的是接触时间,而不是效应

急性毒性试验可以得到的毒性参数:
①绝对致死剂量或浓度(LD100或LCl00) ②半数致死剂量或浓度(LD50或LC50) ③最小致死剂量或浓度(MLD,LD01或MLC,LC01) ④最大耐受剂量或浓度(MTD,LD0或MTC,LC0) 或称为最大非致死剂量(MNLD)

急 以性 死毒 亡性 为的 终上 点限 参 数 非 致急 死性 性毒 急性 性的 毒下 性限 作参 用数 为, 终 点

⑤急性毒性LOAEL(观察到有害作用的最低剂量) ⑥急性毒性NOAEL(未观察到有害作用的剂量)

通过病理组织学和中毒症状观察等手段测定

二、急性毒性试验的目的
?
?
急性毒性试验是外源化学物毒性评价的第一步。

①测定毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数,LD50为最
主要的参数,并根据LD50值进行急性毒性分级。其他毒性参数 还有LD100、LD01、LD0等。

?

②通过观察动物中毒表现,毒作用强度和死亡情况,初步
评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应(效应)和 对人类的潜在危险性程度。

?
?

③为蓄积性试验、亚慢性和慢性毒性研究及其他毒性试验
提供接触剂量的设计依据,并为观察指标的选择提出建议。

④为毒理学机制研究提供初步线索。

三、急性毒性试验的设计
? (一)实验动物的选择
? (二)各组剂量值与组数的确定 ? (三)各组动物数及实验动物分组 ? (四)实验动物的喂养 ? (五)实验动物的染毒方法 ? (六)试验周期 ? (七)毒性观察

(一)实验动物的选择
? 1、选择原则
? 基本要求:
? ①动物对化学物的毒性反应与人基本一致; ? ②操作方便、易于饲养管理、易于获得且价格较低。

? ③此外,应选用纯品系的初成年动物,雌雄各半;
? ④要求选用两种或两种以上的实验动物,一种为啮齿类, 另一种为非啮齿类。

?
?

品系指用计划交配的方法获得的起源
于共同祖先的一群动物。 同一品系的动物具有共同的遗传来源、 相似的外貌特征、独特的生物学特性及稳

定的遗传性能。

2、动物种属选择
? 啮齿类:大鼠、小鼠、兔子; ? 非啮齿类:猫、狗、猪、猴等。
? 急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔,优 先考虑白色家兔。

? 而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑
大鼠。

?

另外,由于不同种属动物其生理状况 不一,在做实验时要根据实验需要注意:
?啮齿类动物:无呕吐反应 ?猫、狗:呕吐反射灵敏,可用于研究引发呕吐 的实验。 ?兔、豚鼠:多用于经皮肤接触的毒作用研究。 ?猴:用于一些特殊的实验。

----实验动物的选择 ----种属和品系
啮齿类动物:是哺乳动物 中种类最多分布范围最广 的一个类群,上下颌只有 一对门齿,门齿无根,能 终生生长。

BALB/c小鼠

C57BL/6小鼠

BALB/c-nu裸小鼠



SD大鼠

金黄仓鼠

豚鼠

非啮齿类动物:
犬 猴 猪

小鼠则以昆明种、NIH、ICR为多

豚鼠 ,皮肤致敏试验首选

----实验动物的选择
-----微生物学等级和饲养环境

(1)按微生 物控制程度分 类

四级 无菌动物 隔离系统 三级 无特定病原体动物(SPF) 屏障系统

二级 清洁动物 半屏障或屏障系统 一级 普通动物 开放系统
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普通动物(CV,Conventioal animals)
是未经积极的微生物学控制,普遍地饲养 在开放卫生环境里的动物。垫料和食物不经高 压消毒,饮水为自来水。 鼠应排除肺炎病毒,沙门氏菌和链球菌, 地鼠不应有蛲虫。普遍动物只能供一般性实验, 不适用于研究实验。

清洁动物(CL,Clean animal)
除普通动物应排除的病原体外,不携带对动物危害 大和影响科学研究的微生物。

垫料、饲料、用具等均应经过高压消毒。鼠盒上带 过滤帽,空气亦应经过一定的过滤,工作人员穿干净服 装操作,此类动物的微生物控制标准基本与SPF相同, 不同之处为血清病毒抗体检查(脑脊髓炎病毒、鼠肝炎 病毒……)经常可检出一定滴度的抗体,但不允许出现 临床症状和脏器的病理变化和自然死亡。

无特殊病原体动物
Specific pathogen free(SPF)animal
简称SPF动物。非特定的微生物和寄生虫是不允许 存在的,故其实际上就是指无传染病的健康动物。

由于用疫苗和药物进行预防及治疗,或用淘汰带菌 动物来作出SPF动物的方法并不实用(既浪费时间,又 难保确实除去病原)。故一般大多先培育出无菌动物或 悉生动物后,再把其转移到有封闭系统(Barrier System)的设施中饲育繁殖。原则上SPF动物室内是不 允许存在病原菌。

无菌动物(Germ free animals)
是指机体内外均无任何寄生物(微生物和寄生虫) 的动物。此种动物在自然界中并不存在,必须用人为的 方法培育出来。 其法:一般将临产前的健康动物用麻醉药品或颈椎 臼法处死后,立即浸泡在37℃灭菌液中,送进无菌室 (或无菌隔离器),按无菌手术进行剖腹,切除带胎子 宫(子宫内首先应无菌),将其浸入消毒液里并输送到 另一隔离器中,切开子宫取胎,经用灭菌纱布揩拭仔体 并断脐(电刀切断)后,放隔离器内人工喂乳或用其它 品系的无菌母鼠作保姆供养。

悉生动物(Cnotobiotes animals)
是指机体内带着已知微生物(动物或植物)的 动物。此种动物原是无菌动物,系人为的将指定微 生物丛投给其体内,例如使大肠杆菌定居在无菌小 鼠体内,在进行微生物检查时,仅能检出大肠杆菌。 亦有人工投给二种以上的已知微生物。悉生动物一 般分为单菌(Monoxenie)、双菌(Dixenie)、三 菌(Trixenie),或多菌(Polyxenie)动物。

(2)按遗传学控制分类
相同基因类型 — 近交系
是采用兄妹交配(BXS——brother sister) 或亲子交配(PXO——parent offspring,父母 与子女交配),连续繁殖20代以上而培育出来的 纯品系动物。一般以小鼠为典型代表。 优点:基因纯正 缺点:价格昂贵,抵抗力差
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突变系动物(Maiant strain animals)
是保持有特殊的突变基因的品系动物,也 就是正常染色体的基因发生了变异的、具有各 种遗传缺陷的品系动物。生物在长期繁殖过程 中,子代突变发生变异,其变异的遗传基因等 先天性无胸腺 位点可遗传下去,或即使没有明确的遗传基因 等位点,但经过淘汰和选拔后,仍能维持稳定 的遗传形质。 nude小鼠

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杂交群动物(Hybrid animals)

也称杂交一代动物或系统杂交动物。是指两 个近交品系动物之间进行有计划交配所获得的第 一代动物。简称F1动物。一般只用子一代F1,有 时也用子二代F2。例如由C57BL/6J和DBA/2小鼠 交配后培育的第一代为DBF1或D2B6F1,C57L/J 和A/He交配后的第一代为LAF1。 最理想的品系:基因纯正,杂交优势

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封闭群动物(Closed colony animals)
是指一个动物种群在五年以上不从外部引进其 他任何品种的新血缘,由同一血缘品种的动物进 行随意交配,在固定场所保持繁殖的动物群。一 般对群的大小、封闭年月、繁殖结构等均有明确 的规定。 一般至少连续繁殖4代以上。常见有:NIH小 鼠、ICR小鼠、SD大鼠、Wistar大鼠、Harley豚鼠 和新西兰兔等。 毒理最常用的品系:基因较纯,抵抗力强, 经济,易获得。
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急性毒性试验所用大鼠的品系以
SD、Wistar为主;

?试验动物的年龄和体重:
? 急性试验动物不宜过老或过幼,通常要求选择刚 成年动物进行试验,而且须是未曾交配和受孕的动物。 例如:大鼠180~240g、小鼠18~25g、家兔2~2.5kg、 豚鼠200~250g、狗10~15kg。同一批试验动物体重变

异范围不应超过该批动物平均体重的20%。

动物年龄和体重的选择
急、慢性实验动物年龄、体重选择
动物种类 小 鼠 大 鼠 豚 鼠 家 兔 猫 小 狗 狗 寿命 (年) 1.5~2 2.0~2.5 6~8 4~9 10~12 15~20 成年 时间 (月) 2 3 2 3~4 3~4 3~4 体重 (克) 15 150 250 1500 1000 体重选择范围 急性试验 18~25 180~240 200~250 2000~2500 1500~2500 1500~2500 8000~15000 慢性试验 15~18 50~100 150~200 1200~1500 1000~1500 1200~2000 4000~6000

? 试验动物的性别:
? 急性毒性试验的主要内容是求LD50,除特殊要 求外,一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各

半。
? 如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、 雄动物毒效应的敏感性有明显差异,则应单独分别 求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致 畸试验作准备,也可仅作雌性动物的LD50测试。对

精子毒性试验仅选雄性动物。

以大鼠、小鼠为例
? ? 急性试验选用成年动物:大鼠180g,小鼠18g。 亚慢性试验选用两种性别,断奶后1~2周的动物。小 鼠体重12~15g,大鼠80~100g。每组不少于20只。 慢性试验择选用两种性别,刚断乳的动物,小鼠生后 3周内,体重8~10g,大鼠生后3~4周,体重50~80g。每 组不少于40只。 若在试验过程中分批处死动物时,其动物数应相应增 加。实验结束时每组不少于10只。

?

?

检疫观察期
?
时间:1~2周。 ? 目的: ? 一是让外购来的实验动物适应本试验室条件, 减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响; ? 二是筛检健康等不符合试验要求的动物。 ? 此外,对狗还应做肠道寄生虫检查或直接进 行驱虫。 ? 实验前应隔夜空腹约16h,饮水不限。 ? 防止动物交配及受孕。

(二)各组动物数及实验动物分组
? 每组动物数:小鼠≥10只,大鼠6~8只,家 兔4~6只;
? 每组动物一般雌雄各半; ? 采用随机方法将动物分配于各组。

实验动物的随机分组方法
?

1.将实验单位随机分成两组 ? 设有小鼠14号,试用随机数字表将其分成两组。先将小鼠依次编为1、 2、3……14号,然后任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录14个 数,编排如下:
实验动 物编号 随机 数字 归组
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

16

22

77

94

39

49

54

43

54

82

17

37

93

23

B

B

A

B

A

A

B

A

B

B

A

A

A

A

现令单数代表A组,双数代表B组。结果列入A组的动物有8 只,列入B组的动物有6只。

调整前分组

?

如要使两组相等,须 将A组减少一只,划入B组。 A 3 5 6 应把哪一只小鼠划入B组, 仍可用随机数字表,在上述 B 1 2 4 抄录的14个数后面再抄录一 个数字为78,此数以8除之, 调整后分组 因为归入A组的小鼠有8只, 故以8除,得余数6。于是把 A 3 5 6 第6个A(即编写为第12号的 小鼠)划给B组。经过这样 调整,两组小鼠的分配如下。 B 1 2 4

8 7

11 9

12 10

13

14

8

11

13

14

7

9

10

12

?

将实验单位随机分成三组 设有动物15只,随机等分成A、B、C三 组。将动物编号后,按上述方法,从随机数字表抄录15个数字,将各 数一律以3除之,并以余数0、1、2代表A、B、C,结果归入A组的动物6 只,归入B组的动物4只,归入C组的动物5只,即:
1 18 2 62 3 40 4 19 5 12 6 40 7 83 8 95 9 34 10 19 11 44 12 91 13 14 69 03 15 30

编号 随机 数字

余数
归组

0
A

2
C
A B C

1
B
1 3 2

1
B

0
A
5 4 7

1
B
13 6 8

2
C

2
C
14 9 11

1
B

1
B
15 10

2
C

1
B

0
A

0
A

0
A

12

?

要使三组的动物数相等,须把原归B组的6 只动物中的1只改配到C组去。可以随机数字表 继续按斜角线抄录一个数字,得60,以6除之, 除尽(相当于余数为6),就可以把第六个B (即12号)动物改为C组。调整后各组的动物编 号如下:
A B 1 3 5 4 13 6 14 9 15 10

C

2

7

8

11

12

? 随机数字产生: ? (1)查随机数字表;(2)由SPSS或EXCEL产 生。 ? 分组步骤: ? (1)将动物编号;(2)按照一定顺序查随 机数字(小于组数的不要,往后查);(3)用随 机数字除以组数,余数(0、1、2、3、….)为归 入的组数;(4)各组动物数的调整。往后继续查 表(多几只则查几个数字),用随机数字除以该 组动物数,其余数为应拿出的动物数。

(三)实验动物的饲养
? 温度:22±3℃; ? 湿度:30%~70%; ? 无对流风;

? 笼养数适宜;
? 人工昼夜;

? 常规饲料、自由饮水。

(四)各组剂量值与组数的确定
?研究受试物急性毒性 →先测其LD50 →化学结构与理化性质
→寻找参考物质 →以LD50(参)为预期毒性中值 →以4或1.6为剂量比值进行分组和预实验 → 确定大致致死剂量范围 → 正 式 试 验 的 组 数 n 与 组 距 i → 进行正式急性试验。

?1.预试验
(1)查阅文献
?①了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的 状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、 水溶性和脂溶性等理化特性,生产批号及纯度,杂 质成分与含量等。 ?②确定使用哪一种计算方法求 LD50 ,然后再设计剂 量分组。 LD50 的计算方法常用寇氏法、概率单位法、 霍思法等。 ?③找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学 物的毒性资料,并以文献资料中相同的动物种系和 相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物 的预期毒性中值。

?(2)预试验的剂量设计
?① 等比剂量设计(已知LD50 剂量 ,并在该剂

量的上下各设计 l 一 2 个剂量组作为预试 验剂量。)
?② 3×3法:取9只动物,分为3组,每组3只, 以三种不同剂量处理,组距拉大一些。(对于 无资料可参考的受试物,为节省动物。) ?③ 序贯法 : 将动物一只一只序贯进行。(对 于无资料可参考的受试物,为节省动物。)

受试物的成分、配方应稳定不变:
一般为新鲜配臵(除非是很稳定的): 水溶性:蒸馏水或去离子水 注射用:生理盐水 脂溶性:色拉油、玉米油、0.5%羧 甲基纤维素钠

? (3)预试验的目的 ? 得到受试物对实验动物以某种接触途 径的10%-90%致死剂量范围。

? 2.正式试验;
(1)根据预试验的死亡资料确定正式实验组距:

可根据以下公式计算出剂量组距:

? i=(logLD90-logLD10)/(n - 1)或 ? i= (logLD100-logLD0) (n - 1)
式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差); n为 设计的剂量组数。 以最低剂量组( LD10 or LD0 )剂量对数 + i ,再查反 对数表即为第2组的剂量,依次类推。

?

剂量组的设臵应依据预试验结果而定。 ? 最高、最低剂量相差2-4倍,至少应设3- 4组; ? 最高、最低剂量相差4-9倍,至少应设4- 5组; ? 最高、最低剂量相差10倍以上,至少应设6组。 ? 一般来说,最高最低剂量多在10倍以内,通常 设臵5-7个剂量组,即符合统计计算要求又可节 省人力财力。

剂量: 不宜过大
推荐的受试物给以容量 (ml/kg)

灌胃
常用
小鼠(10g/ml) 0.1

腹腔注射
常用
0.05-0.1

限量
0.2-0.5

限量
0.3-0.5

大鼠(100g/ml) 1 2-5 0.5-1 1-2 达到5g/kg,实验动物无明显毒性体征,或 者无死亡,一般不再求LD 。

(五)实验动物染毒方法
? 1、染毒途径的选择: 染毒途径(exposure routes)的选择 需考虑的因素:模拟人在生活和生产环境 中实际接触受试物的途径和方式;有利于 不同化学物之间急性毒性大小的比较;受 试物的性质和用途;各种受试物毒性评价 程序的要求等。 最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、 经皮及注射途径。

? 工业化学物:经皮肤和呼吸道 ? 农用化学物:经口、经皮肤和呼吸道 ? 药品:经口和注射 ? 食品:经口 ? 环境污染物:经口、皮肤和呼吸道

吸收速率:
静脉注射>吸入>肌内注射>腹腔注射>经口
>皮下注射>经皮

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2、染毒方法 (1)经口(胃肠道)染毒
新化学物毒性评价的必经之路,一般以 经口途径的LD50值来比较不同化学物急性毒 性大小。 分为灌胃、喂饲、吞咽胶囊等方式。

?经口灌胃染毒:
是实际工作中急性毒性试验中 最主要、最常用的染毒途径。

优点:剂量准确;
缺点:工作量大,有误入气管 和损害食管的可能。
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灌胃量
小鼠0.2?1.0ml/只或0.1?0.5ml/10g 大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只 家兔不超过10ml/2kg 狗不超过50ml/10kg

?喂饲:
将受试物掺入动物饲料或 水中供实验动物自行摄入。
优点:符合人类接触许多化学物 的实际情况,染毒方便; 缺点:剂量误差大、 适口性差、 影响动物摄食和生长发育
? 一般急性毒性试验不用喂饲法。

?吞咽胶囊:
将一定量的受试物装入胶囊中,放 至舌后部,迫使其咽下。 适用于有异味、易挥发、易水解 的物质。 多用于犬、猴的给药 ? 缺点:
?不适用于大鼠、小鼠。

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? 经口染毒的重要注意事项:“禁食”
? 经口接触,动物应事先禁食,以防止胃内容对化合物 毒性的影响。 ? 禁食期间正常给予饮水,染毒2小时后提供饲料。 ? 大、小鼠主要在夜间进食,故应隔夜禁食,如预计第 二天上午给药,则在凌晨开始就应禁食。 ? 家兔、狗等在上午喂食前给予受试物,即可达到空腹 的目的。 ? 例如大鼠食入NaCl:禁食时LD50为3.75g/kg;不禁食时 LD50为6.14g/kg。

(2) 经呼吸道染毒
常用于研究生产条件下以气体、蒸汽、 粉尘、烟、雾等形式存在的工业毒物,环 境空气污染物,以吸入为给药途径的药物。
染毒方式分为吸入染毒和气管内注入; 吸入又分为静式和动式吸入染毒。

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A. 静式吸入染毒

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A. 静式吸入染毒
优点:设备简单、操作方便、受试物消耗量少。
缺点:氧分压下降,柜内受试物浓度逐渐下降,

可能经皮吸收;
不适合较大动物和挥发性不强的受试物。

100L染毒柜可供大鼠1-2只, 小鼠12-15只,呼吸2小时
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B. 动式吸入染毒

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B.动式吸入染毒
由染毒柜、机械通风、配气系统三大部分组成 分类: 1.动式吸入染毒:

将动物整体臵于染毒柜中
2.面罩吸入染毒:

仅将动物的口鼻部分与含有受试物的空气接触
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动式吸入染毒

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动式吸入染毒

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动式吸入染毒 ? 优点:
实验过程中受试物浓度和氧分压较稳定;

? 缺点:
对设备要求高,受试物消耗量大,操作比 较复杂,费时费工。

?

较少采用此法。
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(3). 经皮肤染毒
常用于评价农药、化妆品、外用药物、 工业毒物、环境污染物等。 理论上应采用小型猪、家兔或豚鼠, 但出于经济原因,一般使用大鼠。

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? 研究外源化学物经皮肤接触的目的:
?能否经皮肤吸收及其毒性特征 ?能否引起皮肤损伤 ?吸收速度 ?致死剂量

?

皮肤是多层结构,外来化合物只有穿透角质 层达到真皮才能吸收入血。因此研究经皮肤吸收 是指对完整皮肤而言。 ? 经皮肤吸收有四种结局: ?① 不穿透、不损伤;或少量吸收,但很快降 解,无中毒反应出现。 ?② 经皮肤吸收导致中毒,最终死亡。 ?③ 局部刺激或损伤,不伴有全身中毒。 ?④ 皮肤过敏、光敏反应。

1)经皮肤吸收研究
? 动物选择:
?皮肤解剖、生理特征与人相近的豚鼠、家兔或 小型猪。

? ① 定性试验
?浸尾试验:一般大鼠尾部浸两小时 ?兔耳法:观察双侧兔耳变化

? ② 定量试验
?在试验动物脱毛部位定量涂布受试化合物,以 求出经皮接触的剂量-反应关系。

? 脱毛方法:
? 化学法:脱毛剂 ? 硫化钡+滑石粉 1:4 ? 硫化钠+淀粉 1:4 ? 机械法:剪剃去毛

? 脱毛部位:
? 兔、豚鼠 ? 大鼠 背部中线两侧 尾部、背部中央或腹部

? 脱毛面积:
? 体表面积的10-15% ? 体表面积=10.4W0.667 (W指体重)

? 脱毛后必须观察24小时,确认无皮肤损伤后才能进行实验。 ? 实验方法:
? 可用玻璃钟罩法,接触受试物2-6小时,接触剂量以mg/kg或mg/cm2 表示。

2)局部皮肤作用研究
? 局部作用研究可以结合皮肤吸收试验 一起观察,也可以单独进行。 ① 局部作用研究与经皮吸收实验共同 进行:
?取下玻璃钟罩后,观察局部中毒反应。 ?经皮吸收毒性试验所用剂量大,有时尚未取下 玻璃钟罩,动物可能已经死亡,因此不一定能 观察到完整的局部损伤的变化。

② 单独设计局部作用研究 ? 斑帖法:
?在脱毛区(1 cm2),帖敷浸有受试物的多层纱布, 剂量小于致死剂量,再盖上油纸或塑料布,贴牢 并固定,12-24小时解开,观察皮肤反应。

皮肤反应评分表
红斑、焦痂评分标准
皮肤反应 很淡的红斑(几乎观察不到) 边界清晰的红斑(淡红→鲜红) 中等严重的红斑(鲜红→深红) 有红斑及轻微焦痂出现 评分 1 2 3 4

以水肿过程为评分标准
皮肤反应 评分

很轻微的水肿(几乎观察不到)
轻度水肿(边缘轻度高出表皮) 中等水肿(边缘高出表皮1mm) 重度水肿(边缘高出表皮1mm 以上并超过涂抹范围)

1
2 3 4

?

由于皮肤局部刺激损伤往往发展过程 缓慢,一般评价24小时反应或72小时反应, 取其平均值,称为“原发性刺激指数”。
?指数<2分 轻度刺激 ?指数2-5分之间 中等刺激 ?指数>6分 重度刺激

(4) 经注射途径染毒
常用于药品、化学毒物机制和毒物代 谢研究的急性毒性试验。 可分为:静脉注射(iv)或滴注
腹腔注射(ip) 肌内注射(im) 皮下注射(H) 皮内注射(id)

椎管内注射等。
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各种染毒途径的最大容积,以受试动物的物种或 剂量确定,一般规定染毒的最大容积为:
? ①经口:20ml/kg(对空腹动物); ? ②经皮:2ml/kg;(根据体表面积计算); ? ③静脉注射:1ml/kg(5分钟以上); ? ④肌肉注射:0.5ml/kg(一个部位); ? ⑤吸入:2mg/L; ? ⑥眼:每眼0.01ml; ? ⑦鼻:猴或狗每鼻孔0.1ml; ? ⑧直肠:0.5ml/kg; ? ⑨阴道:大鼠0.2ml,兔1ml。

补充:急性毒性替代试验
*固定剂量法 *急性毒性分级法 *上-下移动法

1、固定剂量法
不以动物死亡为观察终点,预先选定的或固定的 一系列剂量染毒,如5、50、500mg/kg,最高限量是 2000mg/kg。 ? 观察毒性反应,对化学物毒性进行分级。 EEC的急性经口毒性分级标准为:

高毒
有毒 有害

(LD50<25mg/kg)
(LD50为25-200mg/kg) (LD50为200-2000mg/kg)

不分级 (LD50>2000mg/kg)
? 平均用大鼠14.8只,经典方法平均用大鼠24.2只。

2、急性毒性分级法
? 以死亡为终点的分阶段试验法,每阶段3只动 物,平均经2~4阶段,根据死亡动物数,判断急性 毒性。 ? 首选大鼠,从25、200、2000mg/kg体重3个固 定剂量中选择一个剂量开始试验,根据结果判断: ①不需要进一步试验进行分级;②下一阶段以相同 剂量的另一种性别试验;③下一阶段以较高或较低 的剂量水平进行(从200mg/kg体重开始)。 ? 动物观察14天,染毒当天观察体征和死亡至少 两次,之后每日观察一次。每周测体重,所有动物 进行大体解剖,必要时进行组织病理学检查。

3、上-下移动法(阶梯法)
? 以死亡为终点,也可用于观察不同的终点。

? 根据初步资料确定第一只动物接受化学物的剂量,由 第一只动物染毒后的反应决定第二只动物的接受剂量, 如死亡则下一个剂量降低,如存活则下一个剂量增高。 ? 该方法需要选择一个比较合适的剂量范围,使得 大部分动物的所接受的化学物剂量在真正的平均致死 剂量左右。 方法改进后,仅需要6~9只动物。

?

(六)试验期限及观察指标
急性毒性试验 1.一般观察14天
观察和记录内容主要包括5个方面:
1).死亡效应:死亡数是计算LD50的依据,一般情况下, 剂量越大,死亡时间越短,呈负相关 2).中毒体征及发生过程 3).涉及的器官和系统 4).不同化学物出现的毒性症状 5).动物毒性的发生规律

? 2.体重
? 在观察试验动物中毒症状的过程中,应同时观 察体重的变化。 ? 体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改 变的原因很多,若化学毒物刺激或损伤消化道可出 现试验动物饮食减少甚至拒食,表现为体重减轻。 ? 若化学毒物引起腹泻,将影响食物吸收和利用, 体重也会减轻。 ? 如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤, 也可能在体重上反映出来。 ? 所以,对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的 存活动物.应在观察期14天内称量其体重的变 化.以便了解受试物引起毒效应的持续时间。

3. 病理检查及其它指标
对死亡动物进行大体解剖,观察有无充血,水肿 等病理现象。如有改变须取材做病理切片。 对存活动物观察期结束后也进行解剖检查。 根据试验需要可进一步扩大观察项目.如体温、心 电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。

4. 观察时间和周期
高剂量组动物染毒后常在数分钟或数十分钟内出现 死亡,染毒后应立即开始观察动物的中毒表现和死亡情况。 给药当天应连续或多次观察,以后可根据情况,每天 2次或多次观察直到试验周期结束。

经典急性致死试验设计流程图

啮齿类动物急性毒性试验主要的观察项目
器官系统 中枢神经系统 和躯体系统 血液循环系统 呼吸系统 胃肠系统 观察项目或中毒后的一般表现

行为:姿态改变、叫声异常。不安、活动增多或少动 动作:痉挛、震颤、运动失调、麻痹、惊厥、强制性动作 刺激反应:易兴奋,对外界刺激反应过敏或迟钝 肌肉张力:强直,迟缓
心动过速或过缓、心律不齐、血管收缩或舒张 呼吸深缓、呼吸过速、喘息、张口和腹式呼吸

恶心、呕吐、腹泻;便血、尿血、大小便失禁,便秘;粪便 不成型,呈黑色或灰色 阴户、乳腺膨胀、分泌物增多;阴茎突出、遗精;会阴部污 生殖泌尿系统 秽有分泌物 瞳孔放大或缩小,瞳孔对光反射;流泪,上眼脸下垂;眼球 眼 突出、充血,眼球震颤;角膜浑浊 皮肤和被毛 出现红斑、皮疹、水肿、坏死、脱毛、竖毛、松驰

粘膜
其它

结膜或口腔中分泌物增多,充血、苍白、黄疸
直肠或脚爪部皮肤温度降低或升高;姿势异常,消瘦等

LD50的计算:
? LD50及其95%可信限的计算方法有:霍恩氏(Horn)法、 简化寇氏(Karber)法、直接回归法(对数图解法)等。
? 1. 霍恩氏法:限定使用4个剂量组,组距 i 固定,每组动物数相等(4 只系列或5只系列),根据动物的死亡情况直接查表求出LD50及其 95%可信限。
? 2. 简化寇氏法:要求最低剂量组死亡率<20%,最高剂量组>80%,各剂量 组间按几何级数排列。 ? LD50 = lg-1 [Xk – i (∑p – 0.5) ]
? i —— 组距; ?Xk —— 最大剂量对数; ?p —— 各剂量组死亡率; ?q —— 各剂量组存活率;

? Sx50 = i [(∑pq/n)? ]
? LD50的95%可信限 = lg-1(lgLD50±1.96× Sx50 )

?∑p —— 各剂量组死亡率之和;
?n —— 各组动物数; ? Sx50 —— lgLD50的标准误。

四、急性毒性的评价
? 主要参数:LD50或LC50; ? 其他参数: 急性毒作用带( Zac )、剂量反应关系曲线的斜率或LD84 / LD16; ? 中毒症状。

农药的急性毒性分级标准
毒性分级 经口LD50 (mg/kg) <5 5~50 经皮 LD50(mg/kg) 4小时 <20 20~200 吸入LC50(mg/m3) 2小时 <20 20~200

剧 毒 高 毒

中等毒
低 毒

50~500
>500

200~2000
>2000

200~2000
>2000

工业毒物急性毒性分级标准
毒性分 级 剧 毒 高 毒 中等毒 低 毒 微 毒 小鼠一次经口LD50 (mg/kg) <10 11~100 101~1000 1001~10000 >10000 小鼠吸入2小时 LC50 (ppm) <50 51~500 501~5000 5001~50000 >50000 兔经皮LD50 (mg/kg) <10 11~50 51~500 501~5000 >5000

我国食品急性毒性分级标准(1994)
急性毒性分级
6级,极毒 5级,剧毒 4级,中等毒 3级,低毒 2级,实际无毒 1级,无毒

大鼠经口LD50/ (mg · kg-1)
<1 1 ~ 50 51 ~ 501 501 ~ 5 000 5 001~15 000 > 15 000

大致相当于70kg体重人的 致死剂量
稍尝,< 7 滴 7 滴~1茶匙 1茶匙~35g 35 ~ 350g 350 ~ 1 050g > 1 050g

一些化学品的急性毒性/LD50
化学品
乙醇 氯化钠 苯巴比妥钠 DDT 烟碱 河豚毒素 TCDD

动物
小鼠 小鼠 大鼠 大鼠 大鼠 大鼠 豚鼠

染毒途径
经口 腹腔 经口 经口 静脉 静脉 静脉

LD50/(mg · kg-1)
10 000 4 000 250 100 1 0.1 0.001

肉毒杆菌毒素

大鼠

静脉

0.000 01

?急性毒性试验的优点
1、可标准化化学物毒作用强度,比较急 性毒性大小; 2、为后续的重复剂量给药毒理学试验的 剂量选择提供参考等。

? 急性毒性试验的局限性
? 结果不能作为全面反映受试物毒性的 特点,同时还须进行亚慢性毒性、慢性毒 性、以及其他特殊毒性试验,以便有较全 面的认识。

LD50的局限性
1、LD50相近,但是毒性特征、毒作用带或致 死剂量范围可明显不同;

用LD50来描述急性毒性需全面描述中 毒体征及程度、出现体征的时间、死亡前 征兆、死亡的时间和剂量组间分布、存活 动物的体重变化和恢复情况、死亡动物的 病理变化等。

2015-6-21

96

2、死亡为观察指标,仅作为初步判断。其 变异依赖多种因素影响,即同样品系在不 同实验室其结果差别大,从分级亦可看出。

第二节 蓄积毒性作用及其评价
?一、基本概念
? 如果一种外源化学物反复多次进入机体而其 前次进入剂量尚未完全消除,则该化学物在体内 的总量将不断增加并贮留,此现象称为化学物的 蓄积作用。化学物的这种性质称为蓄积性。

?

物质容易蓄积的组织部位称为贮存库。

储存库(depot):化学毒物容易蓄积的组
织部位称为储存库。
常见的储存库: 肝肾-金属镉、汞 骨骼-氟、铅 脂肪组织-有机氯 铅---- 神经系统; 血液系统

? ? ?

有机氯---神经系统, 血液系统

储存库不同于靶器官

―蓄积”的含义:
物质蓄积(material accumulation): 化学分析的方法能够测出机体内存在 该物质或其代谢产物时。 功能蓄积(functional accumulation): 多次接触一定时间后,虽不能测出该 物质或其代谢产物,但机体有慢性中毒的 症状出现。

蓄积作用的意义:

?

蓄积作用是外源化学物引起慢性中毒 的物质基础,也是制定食品卫生标准时选 择安全系数的一个依据。

蓄积性的决定因素:

进入机体 的速度

从机体消 除的速度

二、蓄积毒性试验方法及其评价
① 蓄积系数法;
② 生物半减期法; ③ 蓄积率测定法; ④ 蓄积作用带法。

(一)蓄积系数法

? 蓄积系数 K =

ED50(n)



LD50

( n)

ED50 (1)

LD50 (l)

? n —— 多次接触受试物时产生预期效应的染毒剂量之总和;
? 1 —— 一次接触受试物产生相同效应的剂量; ? ED —— effective dose(有效剂量);

? LD —— lethal dose(致死剂量)。

蓄积系数分级标准
蓄积系数 K
<1
1~

蓄积毒性分级
高度毒性
明显毒性

3~
≥5

中等毒性
轻度毒性

蓄积系数法类型:

?1. 固定剂量法;

?2. 定期递增剂量法;
?3. 20d试验法。

1. 固定剂量法:
① 测定LD50;
② 试验组(相同动物,2-4组,每组10-20 只,雌雄各半)每日定时、“定量”对动 物染毒(剂量:在1/20 ~ 1/5 LD50选择); ③ 出现半数死亡或染毒剂量累计达到5 LD50 时,终止试验; ④ 计算 K 值,并进行评价。

2. 定期递增剂量法:
? ① 测定LD50;
Ⅰ期(1~4天),剂量:1/10LD50;

Ⅱ期(5~8天),剂量:1.5/10LD50;

? ② 染毒:

Ⅲ期(9~12天),剂量:2.25/10LD50; Ⅳ期(13~16天),剂量:3.375/10LD50; Ⅴ期(17~20天),剂量:5.0625/10LD50;

? ③ 出现半数死亡或20天后终止试验: ? ④ 计算 K 值,进行评价。

3. 20d试验法:
① 分组染毒:200g成年大鼠(或成年小鼠),每组20只, 雌雄各半。
Ⅰ组,剂量:1/20 LD50 Ⅰ组,剂量:1 LD50 Ⅱ组,剂量:2 LD50 Ⅲ组,剂量:4 LD50 Ⅳ组,剂量:10 LD50 对照组

Ⅱ组,剂量:1/10 LD50
Ⅲ组,剂量:1/5 LD50 Ⅳ组,剂量:1/2 LD50 对照组

染毒20d

②再继续观察7天 ③ 结果评价: 如1/20 LD50组出现动物死亡,且有剂量-反应关系,
则为强蓄积性;若仅有1/2LD50组动物有死亡,则为弱蓄积性。

(二)生物半减(衰)期法
? ? 生物半减(衰)期:是指进入机体外来化学物消除一 半所需的时间。 原理:如果一种化学物每次进入机体的时间间隔>t1/2,

则在体内蓄积的可能性小;时间间隔<t1/2,则容易蓄积;
如二者相等也将蓄积。 ? 一般t1/2 越长,化学物蓄积可能性越大。

?

一种化学物无论t1/2长短,时间间隔为t1/2给药,经6个
t1/2的接触期限就可达到蓄积极限(98.4%)。

(三)蓄积率测定法
蓄积率:是指在一定时间内,外来化学物在体内的蓄积 量占同一时间进入机体总量的百分比。

蓄积量

蓄积试验组

对照组

蓄积率 =

对照组LD50-蓄积试验组LD50 蓄积期间给予试验组动物受试物总量

×100%

(四)蓄积作用带法
蓄积作用带 =

LC50
慢性阈浓度

蓄积作用带
≤10 10~

蓄积性分级
弱 中等

100~
1000~

明显


死亡指标的缺陷:
? 实例:用死亡指标测定氯丁二烯的蓄积毒
性为弱蓄积性,推论其慢性毒性弱。实际上动物 长期低剂量接触氯丁二烯能引起肝损害为主的慢 性中毒。

?

原因:氯丁二烯一次染毒是引起动物中枢

麻痹而致死,但在蓄积毒性试验中氯丁二烯的靶 器官为肝脏,其所引起的肝损害达不到致死的程 度,而得出错误的结论。 ? 若改用肝损伤为观察指标,可得出正确结论。

三、机体的耐受性:
? 在一些情况下,某种外源化学物持续 多次对机体染毒,但没引起预期毒效应, 必须进一步加大剂量才行,这种现象称为 机体对该化学物的耐受性或习惯性。

第三节 亚慢性、慢性毒作用及其评价
? 一、基本概念与试验目的 ? (一)亚慢性毒性作用
? ? 亚慢性毒性作用:试验动物连续多日接触较大剂 量的外源化学物所出现的中毒效应。 较大剂量:剂量上限<LD50

?

连续多日:约相当于实验动物寿命的1/30~1/10 的时间。无严格统一的规定,主要由实验目的来定。

?

? 亚慢性试验目的: ? 主要为慢性毒作用试验进行探索性或准备性 工作。 ? 包括: ? 1、探讨试验动物长期接触外来化学物可引起 有害作用的剂量,估计其慢性接触危险性及安全 限量标准,为慢性毒性试验提供接触剂量的设计 范围; ? 2、探讨亚慢性毒性的阈剂量、最大无作用剂 量及确定毒作用性质、毒效应类型和靶器官,确 定慢性毒作用试验的观察指标; ? 3、了解受试物对动物生殖及对子代的致畸 作用。

(二)慢性毒性作用
? 慢性毒性作用:使试验动物长期低剂量接触
外源化学物所引发的毒性效应。

?
?

慢性试验目的:
通过确定化学物的慢性毒性特征及其慢性阈 剂量和最大无作用剂量,为最终评价受试物能否 用于食品,及其安全限量的制定提供依据。

二、亚慢性毒性试验的设计
? (一)试验动物的选择和喂饲环境
a. b. 对受试物的代谢接近人类; 选择敏感种属品系,并兼顾慢性试验;

c.
d. e.

刚断乳的幼龄动物,如大鼠出生后4周,体重50g;小鼠 出生后3周,体重10g左右;
品系一致,体重相近,组内个体差异<平均体重±10%, 组间平均体重差异<5% ; 其他要求。

? 饲料营养平衡,环境稳定适宜。

? (二)剂量选择与剂量分组
? 上限剂量参考急性毒性的阈剂量,或以LD50 的1/20-1/5为最高剂量。组距可根据死亡剂量- 反应曲线斜率和蓄积系数,选择3-10倍的比例。 死亡曲线斜率平坦,蓄积性强的,组距要大些。

? ?

亚慢性试验应设计3-4个染毒组和一个对照
组(必要时设臵溶剂对照组);

每组动物数大鼠20-40只,免10-20只,狗6
-8只,雌雄各半。

? (三)染毒途径
? ? 一般采用喂饲法; 每日应定时染毒,以保持化学物每日相似的 生物效应。

? (四)试验周期
? 一般占实验动物生命的1/10。

(五)毒性观察指标
? 1. 一般性指标
? (1)一般综合性观察指标 ? ① 体重;

?
?

② 食物利用率;
③ 中毒症状;

?

④ 脏器系数:某个脏器的湿重与单位体 重的比值,通常是每100g体重中某脏器所占 的质量,表示为脏器质量(g)/体重(100g)。

----2、实验室生化指标
240型--全自动生化分析仪

实验室生化指标
肝、肾功能 血液生化指标指标 AST、ALT、ALP

自动尿液分析仪 MAC-120

血象

尿液检测
外观、pH值

红细胞计数

血红蛋白

BUN、Crea

隐血

白细胞计数 及分类 血小板计数

T-BIL、AchE ATP、GLU、 T-CHO

尿蛋白、尿糖

----3、病理学检查

肉眼观 察

病理组织 学检查

组织化 学

透射电 镜检查
123

----4、特异指标
? ? 特异性指标:能反映毒物对机体毒作用本质的特征性 指标,与毒作用机体有关,又是可作为效应生物学标志物。 根据受试物毒性资料,中毒表现或中毒机制进行选择如:

? 有机磷农药——AchE ? 神经毒物-神经行为,神经递质,神经反射

? 心血管毒物:心电图,血压,眼底
? 血液毒物:骨髓象

三、慢性毒性试验设计
? (一)动物选择及饲养环境
① ② 选择刚断乳,且生命期较短的动物; 生物学特性清楚;

③ 品系明确一致;
④ 雌雄各半。

? 环境:严格稳定适宜,营养:严格均衡合理。

小资料

实验动物品系类型:
按遗传学控制分类:
① 近交系:全同胞兄妹或亲子之间连续交配20代以上而培 育的纯品系动物。如津白Ⅰ、BABLC/c小鼠;F334大鼠 等。 ② 杂交群(杂交1代,F1代):两个不同的近交系之间有 目的进行交配,所产生的第1代动物。 ③ 封闭群:一个种群在5年以上不从外部引进新血缘,仅由 同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。如 昆明种小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、ICR小鼠;Wistar 大鼠、SD大鼠等。 根据实验动物遗传的均一性排序,近交系>杂交群>封闭 群。

(二)剂量选择与分组
最高剂量组:亚慢性阈剂量的1/5~1/2; 轻微毒效应剂量组:亚慢性阈剂量的1/20~1/10; 预计阈剂量组:亚慢性阈剂量的1/50~1/20; 预计最大无作用剂量组:亚慢性阈剂量的1/100或NOAEL的 1/10或人群实际最大摄入量的10~50倍; 对照组。

?一般每组动物大鼠40~60只;

? (三)染毒途径
? 多采用经胃肠(一般采用喂饲法)与呼吸道 接触。

? (四)试验周期
? 一般1~2年;若慢性试验与致癌试验结合进行, 应终身染毒。

(五)观察指标的选择
观察指标的选择以亚慢性毒性试验为基础,
选择亚慢性毒性试验中呈现有意义的指标。 毒性指标观察注意事项:
? ? ? ? ? 试验前应检查并剔除特殊个体; 指标观察应与对照组同步; 检查方法需准确可靠; 须定期动态观察; 详尽检查与保护动物兼顾。

四、亚慢性、慢性毒作用评价
(一)亚慢性毒作用评价:
毒效应性质 亚慢性毒效应资料分析 敏感指标或特异指标 为中毒早期诊断和接触人群 的生物学检测提供依据

≤100倍,放弃使用;

亚慢性LOAEL和NOAEL

NOAEL

100~300倍,进行慢性试验; ≥300倍,可考虑用于食品。

LOAEL:最低有害作用水平 NOAEL:无明显作用水平

(二)慢性毒作用评价:
慢性毒效应性质 慢性毒效应资料分析 敏感指标 存在致癌性,放弃使用; ≤50倍,放弃使用; 慢性LOAEL和 NOAEL

无 致 癌 性

NOAEL

50~100倍,专家评议;

≥100倍,

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