Southern Blot原理及实验方法

Southern Blot 原理及实验方法
原理:将待检测的 DNA 分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离, 继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再 与同位素或其它标记物标记的 DNA 或 RNA 探针进行反应。如果待检物中含有与探 针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或 其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途:检测样品中的 DNA 及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 一、试剂 变性液:1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH。 中和液:0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0),1.5mol/L NaCl。 20×SSC:3mol/L NaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠。 以上溶液均在 100Kpa 灭菌 20 分钟。 2×SSC:用无菌移液管吸取 20×SSC 溶液 5mL,加无菌水 45mL。 6×SSC:用无菌移液管吸取 20×SSC 溶液 15mL,加无菌水 75mL。 二、器材 22cm×15cm 瓷盘 操作方法 1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离 DNA。取出凝胶,切去边缘多于部分,EB 染色,在紫外灯下 照相(放一标尺,可从像片中读出 DNA 迁移的距离) 。 2. 将凝胶置于 200mL 变性液中,浸泡 45 分钟,并温和地不断振荡,使凝胶上的 ds-DNA 转变为 ss-DNA,然后用重蒸水冲洗凝胶几次。 3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡 45 分钟,将凝胶中和至中性。 防止凝胶的碱性破坏硝酸 纤维膜。 4. 取一个瓷盘,在底部放一块玻璃板(或一块海绵)使盛器内的 20 倍 SSC 转移滤液低于 玻板表面,在玻板表面盖一张 3mm 的二号滤纸,滤纸两边浸没于 20 倍 SSC 溶液中,在玻 璃和滤纸之间,赶掉所有的气泡。 5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上,赶走两层之间出现的气泡。 6. 裁剪一张硝酸纤维膜,其长与宽大于凝胶 1—2mm,并在角上作记号,以确定滤膜方位。 先把它放在去离子水中润湿后,再放在 20 倍 SSC 溶液中润湿 5 分钟,然后放在凝胶表面, 两层之间不可有气泡。 7. 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸,在 2 倍 SSC 溶液中浸湿,覆盖在硝酸纤维膜 上,同样要把气泡赶走。 8. 把一叠吸水纸(或卫生纸,约有 5—8cm 高,略小于滤纸) ,放置在滤纸上,在吸水纸上 再放一块玻璃板和重约 500g 的重物,放置过夜。 9.转移结束后,移去上面的吸水纸和滤纸,同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜,把凝胶的点样 与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。 11. 把已转移了 DNA 的硝酸纤维膜放在 6 倍 SSC 溶液中振荡浸泡 5 分钟,然后放在滤纸 上吸干溶液。再把它夹在两层滤纸之间,80℃真空干燥 2 小时。 注意事项 (1)将凝胶中和至中性时,要测 pH, 防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。 (2) 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。

Northern Blot 原理及实验方法
原理:在变性条件下将待检的 RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而按照同 Southern Blot 相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。 实验方法: (一)仪器 恒温水浴箱,电泳仪,凝胶成像系统,真空转移仪,真空泵,UV 交联仪,杂交炉,恒温摇 床,脱色摇床,漩涡振荡器,分光光度计,微量移液器,电炉(或微波炉) ,离心管,烧杯, 量筒,三角瓶,等。 (二)材料 总 RNA 样品或 mRNA 样品,探针模板 DNA(25 ng),尼龙膜 (三)试剂 NorthernMax Kit (Cat. # 1940, Ambion, Inc.) 琼脂糖, , DEPC, X 光底片, 底片暗盒, Random Primer, dNTP Mixture,111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,Exo-free Klenow Fragment 和 10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,双氧水, 灭菌水等。 [方法与步骤] 1. 用具的准备: 180 度烤器皿:三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等 4 小时。 电泳槽:清洗梳子和电泳槽,并用双氧水浸泡过夜,用 DEPC 水冲洗,干燥备用。 处理 DEPC 水(2 L)备用。 2.用 RNAZaP 去除用具表面的 RNase 酶污染 用 RNAZap 擦洗梳子,电泳槽,刀片等,然后用 DEPC 水冲洗二次,去除 RNAZap。 3.制胶: 1. 称取 0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中,加入 32.4mlDEPC 水后,微波炉加热至琼脂糖 完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加 DEPC 水补充蒸发的水分) 2. 在通风厨中加入 3.6ml 的 10*Denaturing Gel buffer,轻轻振荡混匀。 注意尽量避免产生气泡。 3. 将熔胶倒入制胶板中,插上梳子 如果胶溶液上存在气泡,可以用热的玻璃棒或其它方法去除,或将气泡推到胶的边缘。注: 胶的厚度不能超过 0.5cm。

4.胶在室温下完全凝固后,将胶转移到电泳槽中,加入 1x MOPS Gel Running buffer 盖过 胶面约 1cm,小心拔出梳子。 (配制 250ml 1*MOPS Gel Running buffer,在电泳过程中 补充蒸发的 buffer。 ) 5.检查点样孔。 4. RNA 样品的制备 在 RNA 样品中加入 3 倍体积的 formaldehyde load dye 和适当的 EB(终浓度为 10ug/ml) 。 混匀后,65℃空气浴 15min。短暂低速离心后,立即放置于冰上 5min。 5. 电泳: 1. 将 RNA 样品小心加到点样孔中。 2. 在 5V/cm 下跑胶(5x14cm) 。在电泳过程中,每隔 30min 短暂停止电泳,取出胶,混 匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp)接近胶的边缘时终止电泳。 3. 紫外灯下,检验电泳情况,并用尺子测量 18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。 注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。 6. 转膜 1.用 3%双氧水浸泡真空转移仪后,用 DEPC 水冲洗。 2.用 RNAZap 擦洗多孔渗水屏和塑胶屏,用 DEPC 水冲洗二次。 3.连接真空泵和真空转移仪,剪取一块适当大小的膜(膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的 5mm) ,膜在 Transfer buffer 浸湿 5 分钟后,放置在多孔渗水屏的适当位置。 4.盖上塑胶屏,盖上外框,扣上锁。 5.将胶的多余部分切除,切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔,并至少盖过边缘约 2mm,以 防止漏气。 6.将胶小心放置在膜的上面,膜与胶之间不能有气泡。 7.打开真空泵,使压强维持在 50~58mbar;立即将 transfer buffer 加到胶面和四周。每隔 10min 在胶面加上 1ml transfer buffer,真空转移 2 小时。 8.转膜后,用镊子夹住膜,于 1x MOPS Gel Running buffer 中轻轻泡洗 10 秒,去除残余 的胶和盐。 9.用吸水纸吸取膜上多余的液体后,将膜置于 UV 交联仪中自动交联。 10.将胶和紫外交联后的膜,在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间) 12.将膜在-20℃保存。

7. 探针的制备 1.在 1.5ml 离心管中配制以下反应液: 模板 DNA(25 ng) Random Primer 2ul 灭菌水 11ul 总体积:14ul 2.95° 加热 3 分钟后,迅速放置于冰冷却 5min。 C 3.在离心管中按下列顺序加入以下溶液: 10×Buffer 2.5ul dNTP Mixture 2.5ul 111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul Exo-free Klenow Fragment 1 ul 4.混匀后(25ul) ,37° 下反应 30 分钟。短暂离心,收集溶液到管底。 C 5.65° 加热 5min 使酶失活。 C 8. 探针的纯化及比活性测定: 1.准备凝胶:将 1g 凝胶加入 30ml 的 DEPC 水中,浸泡过夜。用 DEPC 水洗涤膨胀的凝 胶数次,以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的 TE(PH7.6) 。 2.取 1ml 一次性注射器,去除内芯推扞,将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住,在注射器 中装填 Sephadex G-50 凝胶。 3.将注射器放入一支 15ml 离心管中,注射器把手架在离心管口上。1600g 离心 4 分钟, 凝胶压紧后,补加 Sephadex G-50 凝胶悬液,重复此步直至凝胶柱高度达注射器 0.9ml 刻 度处 4.100ul STE 缓冲液洗柱,1600g 离心 4min。重复 3 次。 5. 倒掉离心管中的溶液后, 将一去盖的 1.5ml 离心管置于管中, 再将装填了 Sephadex G-50 凝胶的注射器插入离心管中,注射器口对准 1.5ml 离心管。 6.将标记的 DNA 样品加入 25 ul STE,取出 0.5ul 点样于 DE8 paper 上,其余上样于层 析柱上。 7.1600g 离心 4min,DNA 将流出被收集在去盖的离心管中,而未掺入 DNA 的 dNTP 则保 留在层析柱中。取 0.5ul 己纯化的探针点样于 DE8-paper. 8. 测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml) 。 1ul

9.预杂交: 1.将预杂交液在杂交炉中 68℃预热,并漩涡使未溶解的物质溶解。 2. 加入适当的 ULRAhyb 到杂交管中(以 100cm2 膜面积加入 10mlULRAhyb 杂交液), 42℃ 预杂交 4 hr。 10.探针变性: 1.用 10 mM EDTA 将探针稀释 10 倍。 2.90℃热处理稀释后探针 10min 后,立即放置于冰上 5min。 3.短暂离心,将溶液收集到管底。 11.杂交: 1.加入 0.5ml ULTRAhyb 到变性的探针中,混匀后,将探针加到预杂交液中。 2.42℃杂交过夜(14~24hr) 。 杂交完后,将杂交液收集起来于-20℃保存。 12.洗膜: 1.低严紧性洗膜:加入 Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2 膜面积加入 20ml 洗膜 溶液),室温下,摇动洗膜 5min 两次。 2.高严紧性洗膜: 加入 High Stringency Wash Solution#2 (100cm2 膜面积加入 20ml 洗 膜溶液),42℃ 摇动洗膜 20min 两次。 13.曝光: 1. 将膜从洗膜液中取出,用保鲜膜包住,以防止膜干燥。 2. 检查膜上放射性强度,估计曝光时间 3. 将 X 光底片覆盖与膜上,曝光 4. 冲洗 X 光底片,扫描记录结果。 14.去除膜上的探针:将 200ml 0.1%SDS(由 DEPC 水配制)煮沸后,将膜放入,室温

下让 SDS 冷却到室温,取出膜,去除多余的液体,干燥后,可以保存几个月。 15.杂交结果 操作应该小心, 但不必紧张。 用于 RNA 电泳、 转膜的所有器械、 用具均须处理以除去 RNAse 酶,以免样品的降解。转膜时,注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡。

RFLP
RFLP 标记是发展最早的 DNA 标记技术。RFLP 是指基因型之间限制性片段长度的差异, 这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性内切酶片段长度多态性)作为 第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中, 但它运用于植物抗性 研究还只是近几年的事。RFLP 能对植物的抗性基因进行定位和分离,利用 RFLP 技术,对 于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者,若能提取纯净 DNA,则可直接从酶切后的电泳 图谱看出其多态性, 利用这一方法可以测定种群内、 种群间不同水平的物种在污染环境下抗 性分化进化水平上的差异。RFLP 技术在用于基因型分型研究的同时,同样的可用于在不同 环境中微生物多样性的研究。 RFLP 技术主要包括以下基本步骤: DNA 提取→用限制性内切酶酶切 DNA→用凝胶电泳分开 DNA 片段→把 DNA 片段转移到滤 膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的 DNA 片段(Southern 杂交)和结果分析。 RFLP 遍布低拷贝编码序列,并且非常稳定,但 RFLP 实验操作繁琐,检测周期长,成本高 昂,不适于大规模的分子育种,在植物分子标记辅助育种中需要将 RFLP 转换成以 PCR 为 基础的标记。 与核酸序列分析相比,RFLP 可省去序列分析中许多非常繁琐工序,但相对 RAPD 而言, RFLP 方法更费时、费力,需要进行 DNA 多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤,仅 对基因组单拷贝序列进行鉴定。但 RFLP 又有比 RAPD 优越之处, 它可以用来测定多态性 是由父本还是母本产生的,也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒 位、 还是由缺失、插入造成的。 1.点的多态性 表现为 DNA 链中发生单个碱基的突变,且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一 个新的酶切位点。Southern 杂交即可诊断。 2.序列多态性 因 DNA 链内发生较大部分的缺失 重复 插入等变异,其结果是即使其内切酶位点碱基 序列没有变化,但原有的内切酶位点相对位置发生变化从而导致 RFLP。


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