Southern blot_图文

Southern印迹杂交
southern blot

基本原理

? Southern杂交是利用标记的探针(probe) 与膜上靶DNA片段进行杂交的技术,检测靶 DNA片段中是否存在与探针同源的序列
? 杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用 的探针(序列已知)进行特异性的靶序列检 测

用途

? 检测样品中的DNA 及其含量 ? 了解基因的状态 (是否有点突变、 扩增重排等)

实验流程图
基因重组 重组质粒提 与转化 取与鉴定 质粒大 量制备 探针 制备
Southern blot

细胞 培养

基因组 DNA制备 PCR

DNA浓度 测定

酶切

探针的制备

变性 随机引物

DNA聚合酶 I Klenow 片段 32P-dCTP (Dig-dUTP), dNTPs

随机引物延伸法标记探针

基因组DNA Southern杂交

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一、基因组DNA的制备 二、基因组DNA的限制酶切 三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳 四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 五、探针标记 六、杂交 七、洗膜与检测

试剂与器材
? 一、试剂 ? 限制性内切酶,DNA加样缓冲液,DNA Ladder Marker,0.25M HCl,变性液(0.5M NaOH,1.5M NaCl),中和液(0.5M Tris- HCl PH7.5,3M NaCl), 转移液20╳SSC(3M NaCl,0.3M柠檬酸 钠,PH7.0),标记探针, 2╳SSC,预杂交液和 杂交液,2×洗液(2×SSC,0.1%SDS),0.5×洗 液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液(0.1M马来 酸,0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20)

? 二、器材 ? 22cm×15cm瓷盘,尼龙膜或硝酸纤维素膜,滤纸, 吸水纸,紫外交联仪,摇床,X线胶片等

Southern blot 过程
基因组DNA经酶切成小片段(EcoR I或 Hind III) 电泳分开各片段(1%琼脂糖凝胶电泳) 变性(双链经碱变性解开成两条单链) 转膜及固定(DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上,紫外交联固 定) 预杂交(减少标记探针的非特异性结合,小分子鲑精DNA为竞 争性封闭剂)

1d

1d
杂交(靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以碱基互补的原 则进行杂交)
洗膜(洗去未与靶DNA结合的探针)

检测(杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色)

1d

实验步骤
一. 基因组DNA的限制性内切酶酶切
(1)HL60基因组DNA10μg 10×Buffer TANGO+ EcoR I(10 u / μl) 16 μl 2 μl 2 μl

总体积
(2)HL60基因组DNA10μg 10×Buffer R 。 Hind III(10 u / μl) 总体积
37℃保温1.5h

20 μl
16 μl 2 μl 2 μl 20 μl

实验步骤
二. 1%琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶,共7个样品 1.基因组DNA10 mg 组 2.酶切样品(1) 一 3.酶切样品(2) 4.阳性对照(pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切 后的8.5 kb线性片段,10pg/ml, 10ml)
5.酶切样品(1) 组 6.酶切样品(2) 二 7.基因组DNA10 mg

实验步骤
三.变性

? 将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇 动20分钟。 ? ddH2O洗2次。 ? 在胶中和液中慢慢摇动15分钟。

实验步骤
四.转移 ? 在搪瓷盘中加入300ml10×SSC,放上培养皿 和小玻璃板

实验步骤
? 将3张长滤纸浸湿,逐张放在玻璃板上,用 移液管的滚动,赶走气泡

实验步骤
? 切除多余凝胶,小心地将凝胶放在滤纸上, 赶走滤纸与胶之间的气泡

实验步骤
? 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上,同 样不能有气泡,然后放上三张浸湿的滤纸, 赶走气泡

实验步骤
? 紧贴凝胶四周各放一张X光片

实验步骤
? 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜 要紧贴滤纸,但不能让滤纸移动

实验步骤
? 用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处,轻轻割断 保鲜膜,但不能割破滤纸。取走滤纸上的保 鲜膜

实验步骤
? 整齐地放上草纸,数张草纸一折二,草纸堆 要高出搪瓷盘边约10cm

实验步骤
? 在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜

实验步骤
五.固定 ? 将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样 槽在尼龙膜上画上槽的位置 ? 正面朝上放在紫外交联仪中,交联固定 ? ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥

实验步骤
六.杂交 ? 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液,,取 经超声粉碎的鲑鱼精DNA(已溶解在水或TE 中)100℃加热变性5min,迅速加到杂交瓶 中,使其浓度达到100μ g/ml。60℃封闭6小 时。 ? 倒出预杂交液,加杂交液,同样加入变性的鲑 鱼精DNA,将探针100℃加热5min,使其变性, 迅速加到杂交瓶中60℃杂交过夜。

实验步骤
七.洗膜
? 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶液I中, 室温洗3次,每次摇动5分钟。 ? 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面皿), 洗2次, 每次摇动15分钟。 ? 将膜在缓冲液1中漂洗3分钟。 ? 在缓冲液2中室温摇动封闭30分钟。 ? 在抗体溶液中室温摇动,孵育30分钟。 ? 用洗膜溶液III洗2次, 每次15分钟。 ? 在缓冲液3中平衡3分钟。
? 当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时,是洗膜的终止点。 上述洗膜过程无论在哪一步达到终点,都必须停止洗膜。

实验步骤
八.检测

? 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温 育0.5-16小时。 ? 当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变 深前, 用Tris-EDTA洗去底物液,干燥保存。

影响杂交的因素
1)待检核酸分子的浓度和长度
浓度越大,复性速度越快,敏感性↑; 分子越大,转膜越困难,敏感性↓; 转膜方法

2)探针的性质(标记效率、浓度,核酸性质)
对于单链探针,浓度越高,杂交率增加; 探针标记方法和检测方法的选择

3)杂交液体积、温度和杂交时间
体积越小,杂交动力学越高; DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20~25℃; 温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓

影响杂交的因素
4)杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率 增加(Na+的作用) 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序 列不完全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液 中较高的盐浓度;

5)非特异性杂交反应:预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针 的非特异吸附

影响杂交的因素

6)杂交后的漂洗:盐浓度、温度、次数, 体积
漂洗从低严谨度→高严谨度

7)固相膜的选择
阳离子尼龙膜

预期结果

预期结果

The end,thank you!


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