Southern_Blot_实验流程(包括原理细节)

Southern Blot 实验流程(包括原理/细节) 一、DNA 的提取 人和哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离通常是在有 EDTA、Sarkosye 等一类去污剂存 在下,用蛋白酶 K 消化细胞,随后用酚、氯仿抽提,经 RNase 处理和纯化来提取 D NA。 (1)取单层细胞,经无钙、镁 PBS 洗一次,用 0.25%胰蛋白酶消化,细胞悬液经 PBS 洗 2 次,弃上清,取细胞沉淀。 (2)加入 2ml 细胞裂解液(10mM Tris HCL,pH8.0,0.1mol/L EDTA,10mmol/L Na CL,1%SDS)充分混匀,加入蛋白酶 K 至终浓度为 0.5~1g/L、Sarkosye 终浓度为 0. 5%,混匀裂解蛋白呈糊状。 (3)50℃水浴 2h,转入 37℃水浴过夜,次日加入等体积饱和酚,轻轻颠倒混匀,以防 止 DNA 断裂,约 3min。 12000r/min 离心 15 分钟(室温) (4)取水相,再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀,去除蛋白质 12000 r/min 离心 15 分钟(室温) (5)再重复步骤(4),再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次 (6)取水相,再加入等体积氯仿,去除酚及蛋白质,颠倒混匀 12000 r/min 离心 15 分钟(室温) (7)取水相,加入 2 倍体积的预冷无水乙醇,沉淀 DNA,混匀-20℃放置 1 小时 12000 r/min 离心 15 分钟(室温) (8)用 70%乙醇洗涤一次,按上法离心将沉淀真空干燥 10 分钟。 (9)加入 RNase A 至终浓度 100mg/L,37℃水浴消化 1 小时,消化污染的 RNA。 (10)加入蛋白酶 K 至终浓度 0.4g/L、Sarkosye 至终浓度 0.5%,混匀,50℃水浴 2 小 时,加入 NaAC 至终浓度 10mmol/L。

(11)用等体积饱和酚各抽提一次,步骤同前。 (12)吸上清,加入氯仿/异戊醇(24:1),按上法再抽一次。 (13)取水相,加入 2 倍体积预冷无水乙醇,-20℃ 1 小时。 (14)取沉淀用 70%乙醇洗一次,真空干燥 10 分钟后溶于少量 TE 中,4℃贮存。 Southern 对 DNA 的质量要求比较高,一般来说,高质量 DNA 样品需具备以下几点: ① DNA 完整性好; ② DNA 纯度高; ③ 勿用 TE 溶解 DNA; ④ DNA 浓度不低于 0.7ug/ul,杂交需模板 DNA 约 20ug/泳道/次 二、引物设计 三、DNA 检测 1、DNA 浓度的测定 DNA 浓度用紫外分光光度计测定,核酸的光吸收值位于波长 260nm 处,蛋白质则位 于 280nm,分别测定后,其 OD260/OD280 的比值应大于 1.8.低于此值,说明 DNA 中仍残留较多的蛋白质,此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于 1.9 表明 DNA 链破坏,断裂严重,已成为小分子,因此操作应轻柔。 取少许 DNA 溶液,经紫外线扫描,吸收峰值位于波长 260nm 处,其纯度应为 OD260 /OD280=1.8, OD260 值为 1 的溶液大约含 50μg/mL DNA,故 DNA 的浓度 (μg/mL)=OD260 值×5 0μg/mL×稀释倍数。DNA 总量(μg)=DNA 浓度(μg/mL)×总体积 (mL) 2、DNA 分子量的测定 DNA 分子量大小测定,可用含溴化乙锭的 1%琼脂凝胶电泳法测定,根据加入标准品 片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小,此技术还可用作分离基因组 DNA,进 一步进行 Southern 吸印分析。

四、探针制备(以 PCR 标记方法为例) 1、标记原理 Dig-dUTP 在 Taq DNA 聚合酶的作用下, 经基因特异的引物 PCR 指数扩增, 可掺入 到新合成的 DNA 分子中,从而完成 DNA 探针的标记。在延伸反应中,每 20~25 个 核苷可有一个 Dig-dUTP 分子掺入到新合成的 DNA 链中。 2、操作步骤 1)探针标记 注意:在探针标记前,必须用普通 PCR 优化反应条件(试剂盒中提供了过量的 Taq DNA 聚合酶及其 Buffer,建议用于条件优化),包括引物、退火温度、延伸时间、 模板量等, 设定好最佳反应条件。 任何非特异扩增可能导致高的杂交背景甚至假阳性。 在标记反应的同时,用普通 dNTP 做一个相同体系的非标记 PCR 扩增。 扩增体系: D 标 Control 组份 加量 10×buffer 2μ l (plus Mg2+) 1μ l 0 引物 F/R 模板 1μ l 1μ l 1μ l 14μ l 0 0.4μ l 1μ l 1μ l 1μ l 14.6μ l 2μ l 加量

PCR 扩增: 95℃ 5min;[ 95℃ 30sec,60℃ 35sec, 72℃ 30sec;] 72℃ 5min; 30 cycles 2)标记探针检测 取标记产物和普通 PCR 扩增产物各 1μl,1.0%的琼脂糖凝胶电泳。由于大分子量的 D IG 掺入,标记产物泳动速度比普通 PCR 产物要慢。所以根据电泳图就可以判断是否 标记上和有没有非特异标记!其余标记产物-20℃保存。 如果要准确检测标记效率(一般不必),取标记产物 1μl 和 Dig 标记的对照 DNA,用 DNA 稀释液按 10 倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。用紫外交联仪或真空烘烤 固定 DNA 探针,按杂交检测方法进行信号检测,然后与膜条上的 Dig 标记的对照 DN A 信号强度对比,推算出标记的探针浓度。如初始模板量较大,可取 1μl 标记产物稀释 10~100 倍后定量。 五、基因组 DNA 酶切 限制性内切酶(RE)可裂解双链 DNA,每种酶的特点是具有高度特异性的 DNA 裂解点 和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同,应根据说明书操作。 单位(U)RE 活性是在 37℃ 1 小时内能将 1μg DNA 所有特异性位点切断的酶用量。若 用两种以上不同的内切酶,要注意 RE 的最适盐浓度,要由低向高逐级添加适量盐逐 个进行 DNA 切割。 通常,10 个单位的内切酶可以切割 1μg 不同来源和纯度的 DNA。 在正式酶切之前先用 20μl 小体系预酶切看是否切得动,然后用大体系 37℃酶切过夜。 1、酶切体系: 组份 10×buffe 4.5μ l r 加量

HindШ 内 切酶 样品 DNA

6.5μ l 25μ g 补足水至 45μ l, 于 37℃水浴

ddH2O 中酶切 20h 每一种酶都有其相应的最佳缓冲液, 以保证最佳酶活性, 使用时的缓冲液浓度应为 1×。 有的酶要求 100μg/ml 的 BSA 以实现最佳活性。不需要 BSA 的酶如果加了 BSA 也不 会受太大影响 酶切完后,取 5μl 酶切 DNA 样品于 1%的琼脂糖凝胶上检测酶切是否充分。如果酶切 充分,灌制 1%的 agrose 胶,加入上样 buffer 后,在 25-30V 稳压电泳 12-24hrs(包 括 DNA Marker)。 2、电泳 1%浓度琼脂糖凝胶、TBE buffer(EB 染料电泳后染) 100ml TBE buffer 中加入 10μl 10mg/ml 溴化乙锭 (EB) ,将凝胶放置其中染色 30 分钟, 照相。 六、转膜 1、将胶裁成 9.8cm×8.0cm 大小,于平皿中用蒸馏水冲洗一次;(此步一定记好胶的 大小,后面裁纸/膜以及杂交液体积的选择都要用到) 2、加入 100ml 0.25 mol/L 的盐酸脱嘌呤,室温振荡 15~30 min,至溴酚蓝完全变成 黄色。(如果限制性片段>10kb,酸处理时间可适当延长;若限制性片段很小,此步 可省略) 3、用蒸馏水冲洗 2 次。加入变性液(1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH)室温振荡 20~30min;至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。 4、用蒸馏水冲洗 2 次。加入中和液(1.5mol/L NaCl、1.0mol/L Tris-Cl , pH7.4)

室温振荡 2×15min; 5、用蒸馏水冲洗 2 次。加入 2×SSC 平衡凝胶和尼龙膜 5min; 6、虹吸印记法转膜 26 小时 1) 在方盘上放置一平板,其上放置一滤纸,滤纸两端搭入盘内浸入 2×SSC 中,用玻 璃棒赶走滤纸和平板之间的气泡。 2) 将凝胶倒置于平台上, 正面朝下,切掉右下角,并用保鲜膜封闭四周以防止吸水纸 接触凝胶的边缘从而接触平板造成液流的短路。 3) 将尼龙膜放于胶上,赶走气泡。 4) 膜上放两张滤纸,其上再放 20 层吸水纸。 5) 吸水纸上放一平板,其上放 500g 左右的重物,目的是建立液体从液池经凝胶向尼 龙膜的上行通路,以洗脱凝胶中的 DNA 并使其聚集到尼龙膜上。 6) 室温下过夜转膜,持续 16 小时以上,期间换纸 2-3 次。 7)完成转膜后,胶染色,观察转膜效果。并标记好序号、加样孔位置和对应分子量标 准的位置,尼龙膜和凝胶直接接触的一面为正面。 8 )用 2×SSC 漂洗尼龙膜一次,滤纸吸干,紫外交联仪下照射固定 DNA(5000μJ /cm2)5min。 七、杂交 1)预杂交:取 8.0ml 65℃预热的 Hyb 高效杂交液(Hyb-100),加入杂交管中,排 尽气泡,65℃杂交炉中预杂交 2h(8-15 转/ 分)。(此步中高效杂交液的用量根据 9.8cm×8.0cm 计算所得,1ml 高效杂交液/10cm2 胶,9.8×8.0=78.4 ) 2)探针变性:将已标记好的探针沸水浴中变性 10 分钟,立即放冰水浴冷却 10min(探 针一经变性,立即使用),。

3)杂交:排尽预杂交液,在 8.0ml 新 Hyb 高效杂交液(Hyb-100)加入 4.0μl 新变 性好的探针(1-3ul/膜, 5-20ng/ml 杂交液), 混匀。 65℃杂交仪中杂交过夜 (8-15 转/分) 。

4)杂交完成后,将杂交液回收置于一可耐低温又可耐沸水浴的管中,贮存于-70℃以 备重复使用。重复使用时,解冻并在 65℃下变性 10min.。 八、洗膜、信号检测((化学显色法) 1)杂交后室温下,20 ml 2×SSC/0.1%SDS 洗膜 2×5min。 2)50℃,20 ml 0.1×SSC/0.1%SDS 洗涤 2×15min。(洗液需要先预热到 50℃) 3)再将膜置于 20ml 洗涤缓冲液中平衡 2-5min。 4)将膜在 10 ml 阻断液中阻断 30min(在摇床上轻轻摇动)。 5)封闭完成后倒出阻断液,加入稀释好的 10ml 抗体溶液,浸膜至少 30min。(AntiDig-AP 在 10000rpm 离心 5min。离心后将 Anti-Dig-AP 用阻断液稀释(1:5000),2.0 μl Anti-Dig-AP 加入 10ml 封闭液混匀) 6)去除抗体溶液,用 20 ml 洗涤缓冲液缓慢洗膜 2 次,每次 15min。 7)去除洗涤缓冲液,在 20 ml 检测液中平衡膜 2 次,每次 2min。 8) 用检测缓冲液稀释 300μl NBT/BCIP 化学显色底物, 在约 15ml 新鲜制备的显色液 中反应显色,在显色过程中勿摇动。 注意:在几分钟内即有颜色开始沉淀,并在 16h 后完成反应。为检测显色程度,膜可 以短时碱暴露于光线下。 9)当达到所需的点或带强度后,用 50ml 双蒸水或 TE 缓冲液洗涤 5 min 终止反应, 照相记录结果。 若是杂交结果不满意,尼龙膜可经过处理进行重杂交。膜重杂交前的处理如下: a. NBT/BCIP 化学显色法

1. 烧杯中盛装适量的 DMF(Dimethylformamid,二甲基甲酰胺), 通风橱内 50-60℃水浴。 注:DMF 是挥发性的,且大约 67℃时能够燃烧。 2. 将膜置于烧杯内,温育至褪色。 3. 用双蒸水彻底淋洗膜。 4. 用 20-30ml 0.2N NaOH,0.1%SDS(w/v)37℃震荡洗涤 2×20min。 5. 2×SSC 平衡数分钟。 6. 空气干燥或立即用于杂交。 b. CDP-Star 化学发光法 膜的存放 a. 若欲再杂交 在塑料袋中密封保存,任何时候膜都不能干。注:欲保持颜色,可用 TE 缓冲液保存。 b. 不再杂交 15-25℃干膜,存放。注:干膜过程中颜色会减淡,为再生颜色,可在 TE 缓冲液中湿 润。 Southern 溶液的配制 1、洗液Ⅰ的配制:250ml (2×SSC,0.1%SDS) 20×SSC 25ml 10%SDS 2.5ml ddH2O 至 250ml 2、洗液Ⅱ的配制:100ml (0.1×SSC,0.1%SDS) 20×SSC 0.5ml 10%SDS 1ml ddH2O 至 100ml 3、洗涤液:250ml (马来酸缓冲液:Tween-20=1:0.3%) 马来酸缓冲液 250ml Tween-20 750ul

4、马来酸缓冲液:(1×) 1L 马来酸 11.607g NaOH 7.88g NaCl 8.77g 定容至 1L,用固体调至 PH7.5,高压灭菌。 5、阻断液(10×) 500ml Blocking Solution 50g 马来酸缓冲液 定容至 500ml 70℃水浴溶化混匀,然后 121℃高压灭菌(高压时盖子要松) 6、20×SSC 1L 在 800ml 水中溶解,NaCl 175.3g 柠檬酸钠 88.2g 10mol/L NaOH 调节 pH 值至 7.0.加水定容至 1L,分装后高压灭菌 7、10%SDS 1L 在 900ml 水中溶解 100g 电泳级 SDS,加热至 68℃助溶,加入几滴浓 HCl 调节 pH 值 至 7.2,加水定容至 1L,分装备用。 注意:SDS 的微细晶粒易扩散,因此称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量 工作区和天平的 SDS,10%SDS 溶液无须灭菌,过滤。 8、TE pH 8.0 1L 10mmol/L Tris?HCl(pH 8.0) 1 mmol/LEDTA(pH 8.0) 9、检测缓冲液(5×) 1L 0.5mTris?HCl 60.57g 0.5m NaCl 29.25g 调 pH 值至 9.5 10、PBS 缓冲液 NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 浓 HCl 调 pH 至 7.4 11、变性缓冲液 1L 1.5M NaCl 87.66g 0.5M NaOH 20g 12、0.25M HCl(脱嘌呤液) 250ml

2.5M HCl 25ml ddH2O 至 250ml 13、2.5M HCl 100ml 浓 HCl 21.55ml ddH2O 至 100ml 14、中和缓冲液 1L 1.5M NaCl 87.66g 1MTris?HCl 121.14gTris,HCl 调 pH7.4 加水至 1L。 1. 用双蒸水彻底淋洗膜。 2. 用 20-30ml 0.2N NaOH,0.1%SDS(w/v)37℃震荡洗涤 2×20min。 3. 2×SSC 平衡数分钟。 4. 空气干燥或立即用于杂交。


相关文档

Southern Blot原理及实验方法
Southern blot实验方法与步骤
Southern Blot操作流程
southern blot 原理及试验方法
Western blot实验操作流程
southern_杂交实验流程
Western Blot试验流程
Southern blot实验方法和操作步骤
Northern_Blot原理及实验方法
免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤
电脑版