southern blot中文说明书

DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I 采 用 地 高 辛 -dUTP 进行随机引物 DNA 标记,碱性标记,利用 CSPD 化 学发光检测,随 时即用。 货号:11 745 832 910 此试剂盒储存条件:-15℃到-25℃。 此试剂盒可对 10ng-3?gDNA 进行 12 次标记反应, 可检测 10×10cm2 面积的杂交膜 24 张。 指导手册 2005.12 版 1 前言 1 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高 辛标记 DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA 的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫 检测 3.8 DNA 印记的洗脱和再杂交 4. 附录 4.1 故障排除 4.2 参考文献 4.3 订购信息 1.2 试剂盒的成分 2 瓶号 标记 内容 包括功能 50?L 地高辛标记 的高效引物 5×浓度的标记混合物:优化的浓度的随机引物,核苷酸, 地高辛 标记的 dUTP(碱标记的) ,Klenow 酶和缓冲液成分 1 DIG-高效引物 随时 可 用 澄 清 的 粘 液 用 于 DNA 的 高 效 随 机 引 物 标 记 20?L 5?g/mL 质 粒 pBR328 DNA (用 Bam HI 线性化) 2 DIG 标记的对照 DNA 澄清溶液 用于 确 定 标 记 效 率 3 管 1mL 3 DNA 稀 释 缓 冲 液 50?g/mL 鱼 精 DNA,10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0 在 25℃ 澄清溶液 50?L 4 抗地高辛的碱性磷酸 酶 结合物 750U/mL 从羊中获取的,Fab 段,结合碱性磷酸酶 澄清溶液 6 管 1ml; 50X 浓度的存储液(18.75mg/ml NBT 和 9.4mg/ml BCIP 溶于 67% (W/V)的 DMSO 中; 可显现淡黄色与棕色; 与碱性磷酸盐反应 澄清溶液 4×100mL 5 氮蓝四唑/5 溴 4 氯 3 吲 唑基磷酸盐 6 封闭液 10×浓度 黄色, 粘液 7 地高辛杂交颗粒 100mL 地高辛杂交液共 4 瓶, 用于 DNA 杂交 (第 17 页配制) 3 附加仪器与所需试剂 除了上表中列出的试剂外,你必须准备一些溶 液。在下表中,你可以找到不同操作程序 需要准备的设备概要。 在每个操作程 序的前面提供了详细的信息。 操作程序 3.2 DIG-DNA 标记 水浴 仪器设备 试 剂 灭菌的双蒸水 0.2M pH8.0 灭菌的 EDTA 3.3 标记效率的半定量 带正电荷 的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲组 合*或者 TE 缓冲液 洗涤缓冲液 马来酸 缓冲液 检测缓冲液, TE 缓冲液 3.4 DNA 转移和固定 紫外光盒 或者商业化可 用于紫外交联的 其他设备 3.5 杂交 尼龙膜,带正电荷* 杂交袋*, 或者耐热 的塑料袋或者滚筒瓶 注意: 当用地高辛杂交缓冲液 工作时, 不要用开口的托盘。 3.6 免疫检测 耐热的塑料袋或者滚筒瓶 杂交袋*合适体积的容器用于 杂交 地 高辛洗涤和封阻缓冲液 组合*,或者 TE 缓冲液 2×SSC 或者 10×SSC 洗涤 缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液, TE 缓冲液 3.7 DNA 斑点的脱色和重新 标 记探针 大的托盘 水浴 10×SSC 10%SDS 0.2M NaOH *标记的产品可以从 Roche Applied Science 获得。 2.介绍 2.介绍 4 2.1 产品概况 实验原则 此试

剂盒采用 DIG(地高辛),一种甾类半抗原,steroid hapten 去标记 DNA 探针用 于杂 交和后续的免疫检测[1,2,3]。 步骤 描述 根据随机引物标记技术采用地高 辛标记引物获得了地高辛标记的 DNA 探针。地高辛标记的高效引物是一种专门 生产的反应混合物, DNA 标记 其中含有地高辛 dUTP,碱性标记(图 1)和所 有的试剂,包括随机 引物标记所必须的酶,已预先混合优化的 5×浓度反应缓 冲液。 根据标准方法,地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。 采用 碱标记形式的地高辛-11-dUTP 能够更加容易和有效的被洗脱 杂交 下来,使固 定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂 交。 杂交探针可以用抗地 高 辛 的 碱 性 磷 酸 酶 进 行 免 疫 检 测 , Fab 段 , 然 免 疫 检 测 后 与 显 色 底 物 NBT/BCIP 发 生 显 色 反 应 图 1 DIG-dUTP , 碱 性 标 记 应 用 地 高 辛 标 记 DNA 探针可以用于: 所有类型的滤膜杂交 总基因组 DNA 中单拷贝基因的检 测, 甚至对于高度复杂的生物体也可以进 行检测,如人,大麦和小麦。 样品 材料 至少 100bp 的 DNA 片段 线性的质粒,cos 质粒或者 DNA 超螺旋 的 DNA 实验时间 此表格列出了每一步实验所需的反应时间。 5 步骤 DNA 标 记 杂交 免疫检测 底物显色检测 反应时间 1 小时-过夜 6 小时或者过夜 1.5 小时 0.5――16 小时 检测数量 一个试剂盒足够用于: 12 个标准的标记反应, 每个反应的膜板 DNA 不超过 3?g; 并可以检测 24 张 10×10cm 的杂交膜。 质量控制 根据操作步骤中的说明对未标记的对照 DNA pBR328 进行标记,并 按照下面的标准检测 操作方法在点杂交中用 0.1pg 同源 DNA 经过 16 小时 显色即可检测到 (或 1pg 的同源 DNA 经 过 1 小时的显色即可看到颜色) 。 2 试剂盒的储存和稳定性 未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃ 到-25℃(保质期印在标签上) 。在 干冰中运输。 一旦开封,请根据下表选择 适宜的储存条件。 试剂盒成分 抗地高辛碱性磷酸酶结合物(4 号管) 封阻液 (6 号管)储存条件 2-8℃稳定。注意: 不要冻存 未开封时 15℃-25℃ 稳定。 一旦开封,应分装并储存在-15℃到-25℃或 者无菌条件下 2-8℃间可以稳定保 存 1 个月。 工作溶液都应是新鲜配制的。 储存在 2-8℃ 在运输过程中用干 冰保存,易生成沉淀,经 37℃溶解即可。 NBT/BCIP(5 号管) 灵敏度和特 异性 灵敏度和特异性 采用 southern 杂交从 0.3?g 人胎盘 DNA(经 Bgl Ⅱ 或 EcoRⅠ酶切)中检测到单拷贝 6 基因(组织纤溶酶原激活因子 tPA) 。注 意:灵敏度取决于标记 DNA 的浓度与显色时间。 优点 此表描述了这个试剂盒 的优点和特征 优点 精确、 快速 特征 预先已混好的地高辛高效引物混合物减少 了 标记 DNA 时手动操作的时间,同时提高了产 量,重复性好 在复杂的总 人 DNA 及植物基因组中能够检测 到单拷贝基因。 地高辛标记的探针可以至少 储存一年。 杂交溶液可以重复利用 3-5 次,重复次数主 要取决于每次杂交中 产生信号的标记探针的 量。 灵敏 省时 3. 实验步骤和所需材料 3.1 在你开

始前 主要的操作要求 此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示: 要求 在 清洁的条件下进行操作 指引 高压灭菌地高辛系统的试剂 过滤灭菌的溶液包括: SDS,吐温 20,并应该 加入到已灭菌的溶液中。 用干净的孵育托盘 处理膜的 要求 每次使用前都要严格地清洗实验托盘 带无粉手套 处理膜的时候,只能够 用干净的镊子夹膜的 边缘 流程图 3.2 部分 地高辛标记 DNA ↓ 7 3.3 部分 标 记效率的检测 ↓ 3.4 部分 DNA 固定 ↓ 3.5 部分 杂交 ↓ 3.6 部分 免疫检测 ↓ 3.7 部分 洗脱和 DNA 斑点与另一探针的杂交 3.2 地高辛标记 DNA 介绍 随 机引物标记的 DNA 带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引物试 剂,这 是一种含有随机六碳糖,dNTP 混合物的 5×浓度标记混合物,其中 dNTP 混合物包括碱性标 记的地高辛-11-dUTP, 标记级的 Klenow 酶和适合的 反应缓冲液。 附加设备和所需试剂 水浴 冰水混合物 此表中列出了成分,储存 条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。 溶液 水 EDTA(乙二胺四乙酸) 模 板 DNA 下表中列出了模板 DNA 所需特征: 特征 详细信息 模板 DNA 应该采 用 the HighPure Plasmid Isolation Kit 进行制备。 纯度 当采用其他商业化的 纯化试剂盒进行纯化时,我们建议额外进行一次 苯酚/氯仿抽提以去除残余的蛋 白质。 在标记之前如果对模板进行限制酶切或者其他酶的修饰作用,那么此 8 成分 高压灭菌的双蒸水 0.2M EDTA,pH 8.0 储存条件/ 储存条件/稳定性 15-25℃,稳定 15-25℃,稳定 用途 稀释 DNA 终止标记反应步骤也是需要进 行的。 为了获得理想的结果,模板 DNA 应该线性化,且大小应该在 100bp 以 上。如果模板 DNA 大于 5kb,那么在标记之前应该采用限制性酶切序列 为 4 个核苷酸的限制性酶(如 Hae Ⅲ)对模板进行酶解。 上面步骤描述原则上 10ng-3?g 的模板均可以标记上,然而请仔细查 看在给定的表中,用于你的杂 交实验所需的探针。可以根据提供的操 作方法放大总体积和成分用量来获得更 大量的标记探针。 如果要检测 如果要检测 复杂基因组中的单拷贝基因, 300ng ( 复杂基因组中的单拷贝基因, 需标记的模板 DNA 用量至少 300ng 探针 ( 浓度: 杂交液) 浓度:25ng/mL 杂交液) 。 大小 数量 标记从琼脂糖凝 胶上分离的 DNA 如果你想要完成基因组的 southern 杂交,你应该利用琼脂糖 凝 胶 电 泳将 插入 载 体的 模 板 DNA 从 载 体 上 分 离 出来 。 为 了从 凝 胶 中 分 离 DNA, 你 可 以 用 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 提 取 试 剂 盒 (the Agarose Gel DNA Extraction Kit)进行大小在 400bp-5kbp 范围内 DNA 片段的回收。 这一试剂盒既可以用于 标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。 然后, 不 需要进一步纯化即可对 DNA 片段进行 高效的地高辛标记。然后标记好的探针 应该用高效的 PCR 产物纯化试剂盒 (High Pure PCR Product Purification Kit) 进行纯化, 以去除残留的琼脂糖颗粒。 步骤 此步骤用于标记 10ng-3?g DNA 。 可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的 DNA (最 高达 10?g) 。 步骤 操

作 向一个反应管仲中加入 1?g 模板 DNA DNA (线性或超螺旋) 和高压灭菌的 双蒸水,终体积达 16?L。 沸水浴 10 分钟以变性 DNA,然后迅速插入冰水混 合物中。 2 注意:完全变性对于标记的有效性是十分重要的。 充分混 合 DIG-High Prime 号管),并取 4?L 加入到变性 DNA 中,混 DIGPrime(1 合 并简单离心。 3 37℃孵育 1 小时或者过夜。 注意: 较长的孵育时间 (最高达 20 小时)能够提高地高辛标记 DNA 的 9 1 产量(见下表) 加入 2?L 0.2M EDTA(pH8.0) 和/或 65℃加热 10 分钟终止反应。 4 注意:采用地高辛高效引 物获得的地高辛标记片段的长度范围可以从 200bp 到 1000bp 甚至更长,这 主要取决于原始模板 DNA 的长度。 标记反应的产量 标记反应的产量 表 1: 此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。 在标准反应中每个 实验采用 1?g DNA 作为模板。 小时内, 1 大约有 15%的核苷酸参与到了 0.8?g 新合成的地高辛标记 DNA 中。 小时后消耗了大约 38%的核苷酸可达到 2ug。 20 模板 DNA 10 ng 30 ng 100 ng 300 ng 1000 ng 3000 ng 1h 45 ng 130 ng 270 ng 450 ng 850 ng 1350 ng 20h 600 ng 1050 ng 1500 ng 2000 ng 2300 ng 2650 ng 使用 DIG-High-Prime 溶液,增加不同模板 DNA 的量进行反应,并检测反 应 1 小时和反应 20 小时的差异。地高辛标记 DNA 的产量由放射线示踪器进 行测定, 并通过斑点杂交进行证实 (10 个独立标记实验的平均值) 。 图 2 来 自于不同量模板 DNA 的地高辛标记 DNA 在 37℃孵育 1 小时和 20 小时后 的产量 10 3.3 标记效率的确定 介绍 地高辛标记 DNA 产量的确定对于获得最 佳的, 具有可重现性的杂交结果十分重要。 在杂 交混合物中探针浓度过高容 易产生背景,而太低浓度则容易导致信号弱。 实验原则 检测标记探针质量的好 方法是直接检测法。 步骤 1 描述 将地高辛标记 DNA 的一系列稀释梯度点到 一小块带正电荷的尼龙膜上。 尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高 辛标记的对照 DNA(2 号管)作为标准。 采用 anti-DIG-AP 结合物(4 号管) 和 预 混 的 NBT/BCIP 存 储 液 进 行 免 疫 检 测 。 以 颜 色 深 浅 比 较 地 高 辛 标 记 DNA 与对照 DNA 的一系列稀释点的强度。 2 所需附加溶液的制备 请找出 下表中的成分和所需制备的试剂。 下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻 缓 冲液无 DNA 酶和 RNA 酶系列产品中获得。 请注意: 标记效率确定实验 中检测部分所需的试剂和工作试剂应与你的杂交实验 (请看 3.5 章) 中化学 发光检测使用的试剂一致。 这些试剂可以大量制备, 在第 3.7 章中也将用到。 溶液 洗涤缓冲液 成分/ 成分/制备 0.1M 马来酸 0.15M NaCl pH 7.5(20℃) 0.3% (v/v)Tween 20 0.1M 马来酸 0.15M NaCl 用 NaOH( 固体 )调 节 pH 值到 7.5(20℃) 0.1M Tris-HCl 0.1M NaCl pH 9.5(20℃) 10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH 8.0 储存/ 储存/稳定性 15-25℃,稳定 用途 去除未结合的抗体 马来 酸缓冲液 15-25℃,稳定 封阻液的稀释 检测缓冲液 15-25℃,稳定 调整 pH 值

到 9.5 TE 缓冲液 15-25℃,稳定 终止显色反应 11 试剂盒工作溶液的制备 下 表中列出试剂盒工作溶液的制备方法: 溶液 成分/ 成分/制备方法 用马来酸缓 冲液按照 1:10 的比例将 10×封阻液(6 号 管)稀释成 1×工作溶液 每次使 用前将原始管仲的 anti-digoxigenin-AP(4 号 管)10000rpm 离心 5 分钟。 然 后从表面小心吸取所需用 量。 用封阻溶液按照 1: 5000 ( 150mU/mL ) 的 比 例 稀 释 anti-digoxigenin-AP 取 40ul NBT/BCIP 存储液 (第 5 号管) 加 入到 2ml 检 测缓冲液中 注意:避光! 储存/ 储存/稳定性 用途 封阻溶液 一 直新鲜制备 封阻膜上非特异结 合位点 抗体溶液 2-8℃,12h 与地高辛标记的 探 针结合 底物显色液 一直新鲜制备 抗体结合点显色 稀释系列 根据合成核 苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释,标记的探针和地高辛标记的对照 DNA (2 号管) 应该稀释到 1ng/?L。 利用第 3.3 章中图表可以最好的估计出在你的 探针中地 高辛标记 DNA 的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。 注意:表 1 中给出的产量是采用高纯度的 DNA 模板在最佳条件下生产出的。 按 照 下 表 中 的 描 述 对 你 标 记 的 探 针 和 你 的 对 照 DNA 进 行 一 系 列 的 梯 度 稀 释。 DNA 稀释缓 冲液 3 号管) ( 号管) (?L) 管 DNA (?L) 来自于管# 来 自于管# 稀释比例 终浓度 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 15 5 5 5 5 5 0 稀释的原液 1 2 2 3 4 5 6 12 1ng/?L 198 35 45 45 45 45 45 50 1:100 1:3.3 1:10 1:10 1:10 1:10 1:10 10pg/?L 3pg/?L 1pg/?L 0.3 pg/?L 0.1 pg/?L 0.03 pg/?L 0.01 pg/?L 0 操作步骤 下面的步骤描述的是直接检测。 注意:在全部的步骤中,用足够的 缓冲液体 积完 全覆盖 膜。 步骤 1 2 操作 分别从你标 记的探 针和标记对 照 DNA 的 2-9 号管中取出 1 ?L 点在尼龙膜上 通过紫外交联或者 120℃烘 烤 30 分钟的方法将核酸固定在膜上 将膜转移到一个装有 20mL 马来酸缓冲 液 马来酸缓冲液的塑料容器中 3 在 15-25℃中振荡孵育 2 分钟 4 5 6 7 在 10mL 封阻液 封阻液中孵育 30 分钟 在 10mL 抗体溶液 抗体溶液中孵育 30 分钟 用 10mL 洗涤缓冲液 洗涤缓冲液洗涤两次,每次 15 分钟 在 10mL 检测缓冲液 检测缓冲液中平衡 2-5 分钟 将膜上带有 DNA 的一面朝上,放在 一个折叠夹上 (或者杂交袋) , 向膜上加入 2mL 的新鲜配制的的底物显色液。 均匀的铺平底物,且膜上不能有气泡。保 持膜静止,避光。15-25℃中孵育到有 颜色出现为止。 注意:可短时间打开看是否有斑点出现。 当出现斑点时,用 50ml TE 缓冲液浸泡膜 5 分钟,用灭菌去离子水也可达到 同样效果。 将结果 扫描或拍照保存。 8 9 结果分析 比较对照与你的标记反应产生的点的强度差异, 并计算出地高辛标记 DNA 的量。 如果你 的探针稀释后量达 0.1pg 的点与对 照 DNA 的点均可见, 那么说明标记的探针达到了预期的标 记效率(见第 3.2 章中表 1) ,能够满足杂交所需的探针浓度。 孵育时间 5-10 分钟 30 分钟 显色浓度 30pg 3pg 13 3.4 DNA 的转移和固定 转移方法和膜 凝胶电泳的标准

操作方法, 胶的变性和中和均参照参考文献中 Sambrook 等的文章。 中不加 胶 入 EB 会 更 好 , 因 为 EB 可 能 引 起 背 景 不 均 匀 的 问 题 。 所 有 普 通 类 型 的 DNA 转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验(7,8) 根据我们的经验, 20×SSC 采用毛细管转印的方法使 DNA 转印到带有正电荷的尼龙膜 用 上可 以获得最好的结果。 注意:碱性转移(如在 0.4M NaOH 中)不适用于地高辛 标记分子量 marker 的转移。 固定操作 将 DNA 固定到膜上可以通过下面的任 何一种操作: 如果你想采用 那么 将膜放到已经用 10×SSC 浸透的 Whatman 3MM 滤纸上。 紫外交联的方法(尼龙膜) 洗涤之前用紫外交联这块湿润的膜 紫外交联后,将膜放入双蒸水中简单冲洗一下,然后自然晾 干。 在 2×SSC 简 单的洗涤一下膜 120℃,烘烤(尼龙膜) 将尼龙膜放在 120℃下烘烤 30 分钟 或者根据操作说明的要求 进行操作。 在 2×SSC 简单的洗涤一下膜 80℃,烘 烤(尼龙膜) 将尼龙膜放在 80℃下真空烘烤 2 小时 膜的储存 请根据下表选 择膜的储存方法。 如果 你想继续实验 如果你想稍后进行实验 那么 立即将这 个膜进行预杂交 那么将干燥的膜储存于 2-8℃ 3.5 杂交 需要的附加设备 需 要的附加设备 冰水浴 14 震荡水浴 或杂交炉 耐高温的塑料或者玻璃盒,培养 皿,滚筒瓶或者可密封的塑料袋 注意:不要用敞口的容器盛放杂交缓冲液 杂交 工作溶液的制备 分两次小心的将 64mL 无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶 (7 号瓶)中,然后立即在 37℃条件下搅拌 5 分钟进行溶解。 杂交温度 适 宜的杂交温度是根据 GC 含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的,具体 的公式 如下: Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度, 以碱基对进行计算} Topt.= Tm -(20~25℃) 这一给出数字的方程式是根据杂 交溶液中含有 50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。 用于地高辛杂交液进行杂 交的实际杂交温度 Topt. 要比计算出的 Tm 低 20-25℃。 Topt. 可 以作为一个 严谨的杂交温度,允许探针和靶序列之间有 18%的错配。当你的探针与靶序列 的 相似度低于 80%时,你应该相应的降低 Topt(大约每 1%的错配要降低 1.4℃) , 同时相应的调 整严谨洗涤步骤 (即提高 SSC 浓度和降低洗涤温度) 。 操作步骤 步骤 1 请参照下表进行实验。 操作 将适量体积的杂交缓冲液提前预 热到杂交温度(37-42℃) 。 将点样后的膜放入杂交缓冲液中在适当的容器中 温和振荡 30 分钟进行预杂交。 注意:膜应该自由的移动。尤其是如果你在同 一个预杂交溶液中放入几张膜。 2 变性地高辛标记的 DNA 探针(在地高辛杂 交液中浓度大约为 25ng/mL)是将探 针放入沸水浴中煮 5 分钟后快速放入冰 水混合物中冷却。 注意:因为 DIG-11-dUTP 是碱标记的,因此 DNA 探针不能 用碱处理(NaOH) 的方法变性。 3 将变性的地高辛标记探针加入到预热的地 高辛杂交缓冲液(每 100cm 的膜加 入 3.5mL 杂交缓冲液)中,充分混合但 要避免产生泡沫(气泡容易产生背景) 倒出预杂交液,向膜上加入探针杂交液

的混合物。 温和振荡孵育 4 小时或延长孵育至过夜。 杂交液的储存 含有地高 辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15 到-25℃,可以反复使用几次,在 每 次使用前需要 68℃新鲜变性 10 分钟。 2 4 15 注意: 不可以将杂交液煮沸。 严 谨洗涤 对于大部分 DNA:DNA 应用,用 0.5×SSC 进行严谨洗涤已经足够。 针 对每个探针来说, 正 确的洗涤条件应该依据经验来确定。 对于人基因组 DNA, 采用的条件是 0.5×SSC,65℃。 探针长度大于 150bp 且 GC 含量高时,应 在 68℃下进行洗涤。 对于长度为 100bp 或更短的探针,洗涤温度应该降低。 此表描述了怎样完成后面的杂交洗涤。 步骤 1 2 操作 用足够的 2×SSC 0.1%SDS 连续振荡洗涤两次,每次 5 分钟。15-20℃. 65-68℃,用足够的 0.5×SSC 0.1%SDS(提前预热到洗涤温度)连续振荡 洗涤两次,每次 15 分 钟。 3.7 免疫检测 需要附加的试剂 请找出下表中的成分和所需制备的试剂。 下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓 冲液无 DNA 酶和 RNA 酶系列 产品中获得。 溶液 成分/ 成分/制备 0.1M 马来酸 0.15M NaCl pH 7.5(20℃) 0.3% (v/v)Tween 20 0.1M 马来酸 0.15M NaCl 用 NaOH(固 体 )调 节 pH 值到 7.5(20℃) 0.1M Tris-HCl 0.1M NaCl pH 9.5(20℃) 10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH 8.0 储存/ 储存/稳定性 用途 洗涤缓冲液 15-25℃,稳定 膜的洗涤 马 来酸缓冲液 15-25℃,稳定 封阻液的稀释 检测缓冲液 15-25℃,稳定 碱性磷酸 酶的缓冲液 TE 缓冲液 终止显色反应 15-25℃,稳定 试剂盒工作溶液的制备 16 下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法: 溶液 封阻溶液 成分/ 成分/制备 方法 用马来酸缓冲液按照 1:10 的比例将 10 ×封阻液(6 号管)稀释成 1× 工作溶液 每 次 使 用 前 将 原 始 管 仲 的 anti-digoxigenin-AP(4 号 管 )10000rpm 离心 5 分钟。然后从表面小心吸取所需用 量。用封阻溶液按照 1: 10000 (75mU/mL) 的比例稀释 anti-digoxigenin-AP 向 10ml 检 测 显 色 液 中 加 入 200ul NBT/BCIP 存储液(5 号管) 。避光保存 储存/ 储存/稳定 性 一直新鲜制备 用途 封阻膜上非特异 结合位点 抗体溶液 2-8℃,12h 与地 高辛标记的 探针结合 底物显色 液 操作步骤 一直新鲜制备 抗体结合点显 色 此表描述了完成一张 100cm 膜的免疫检测方法。 注意:所有的孵育均是在 15-25℃下,振荡完成的。如果膜还需要再次与探针杂交,那么任 何时候都不要 让膜干。 步骤 1 2 3 4 5 操作 杂交和严谨洗涤后,将膜简单的用洗涤缓冲液冲 洗 1-5 分钟 洗涤缓冲液 洗涤缓冲液 在 100mL 封阻液 封阻液中孵育 30 分 钟 在 20mL 抗体溶液 抗体溶液中孵育 30 分钟 用 100mL 洗涤缓冲液 L 洗涤缓冲液洗涤两次,每次 15 分钟 在 20mL 检测缓冲液 检测缓冲液中平衡 2-5 分钟 将膜上带有 DNA 的一面朝上,放在一个折叠夹上(或者杂交袋) , 向膜上加 入 2mL 的新鲜配制的的底物显色液。均匀的铺平底物,且膜上不能 有气泡。 保持膜静止,避光。15-25℃中孵育到有颜色出现为止。 注意:可短

时间打开看是否有斑点出现。 当出现斑点时,用 50ml TE 缓冲液浸泡膜 5 分 钟,用灭菌去离子水也可达 到同样效果。 将结果扫描或拍照保存。 2 6 7 3.7 DNA 印 记 的 洗 脱 和 再 次 探 针 杂 交 主 要 信 息 印 记 中 的 碱 性 标 记 形 式 的 DIG-11-dUTP 能够更容易更有效的被洗脱, 以用于再 一次的杂交实验。 所 需附加的仪器和试剂 大烧杯 水浴 17 10×SSC 0.1% SDS(W/V) 0. 2N NaOH DMF 操作步骤 此操作描述的是膜的洗脱。 注意:如果计划印记需要洗脱和再 次杂交,那么膜在任何时候都不能干。 可选择的洗脱方法,用于 filter 杂交的 地高辛应用操作手册中提到的(可以通过互联 网获得)方法也是一种高效的方 法。 步骤 1 操作 在通风橱里用玻璃大烧杯加热 DMF 到 50-60℃, 将膜放 入加热的 DMF 中, 直到膜 上蓝色脱落。 注意:DMF 易挥发,且高于 67℃ 就会自燃。 2 用双蒸水充分洗涤膜 在 37℃条件下,用含有 0.1%SDS 的 0.2M NaOH 洗涤两次, 每次 15 分钟, 以去除 地高辛标记的探针。 保持晃动。 用 2×SSC 充分洗涤 5 分钟 用另一个探针进行预杂交和杂交 3 4 5 洗脱后的 膜需要的储存条件 一旦膜被洗脱,可以将膜放在马来酸缓冲液中或者 2×SSC 中准备再用。 4 附录 4.1 故障排除 故障排除表 此表描述了用于地高辛标记和 检测的各种故障排除参数。 18 问题 低灵敏度 可能原因 无效的探针标记 建 议 通过与标记的对照 DNA 进行比较,检查你的地高辛标记探 针的标记效率。 延长孵育时间到过夜。 用饱和酚来纯化模板 DNA。 模板必须小于 5kb,大于 5kb 的需要用限制性酶切序列为 4 个核苷酸的限制性酶(如 Hae III)对模板 进行酶切。 确保模板被标记之前已经完全变性。 杂交液里的探针 浓度过低 增 加探针浓度,但不要使用浓度超过 25ng/ml 的 DNA 探针。 研究杂交以及洗涤 条件。 延长杂交时间。 延长显色时间到 16 个小时 高背景 无效的杂交 重新 计算杂交温度。 在预杂交和杂交之间保持膜是湿润的。 用塑料袋杂交的时候, 将气泡排除。 膜的类型错误 许多类型的尼龙膜会导致高背景,用尼龙膜应该用 地高辛 系统检测的,尽管此操作方法非常适用于正电荷尼龙膜的 应用,但是一 些膜由于带有较高的正电荷可能产生背景。 一些膜的批间差异也可能产生此问 题。当使用建议的由本 公司生产的尼龙膜,这些问题都可以避免发生。 封闭无 效 严谨洗涤无效 无效的标记 延长封闭时间和洗涤时间 检查严谨洗涤的温度, 预热洗涤液到合适温度 在标记前采用苯酚/氯仿的方法或者乙醇沉淀的方法纯 化 DNA/RNA。 确定探针不含有交叉杂交的载体序列 有污点 标记探针的浓度 过高 试验所用的托盘必须经过严格洗涤, 地高辛标记和显色的 盘子应该是单独 使用的 重要:降低地高辛标记 DNA 的浓度是必须的。 可以对未点样的膜进行 杂交并不断提高探针浓度,来确定 加入探针浓度的限度。 注意:不要让膜在整 个 操 作 过 程 中 干 燥 。 右 侧 的 为 KIT II 上 帝 解 释 抗 体 浓 度 过 高 降 低 anti-DIG-AP 结合物的浓度。增加洗涤液,封阻液的 体积,延长洗涤和封闭步

骤的时间。 有斑点出现的背景可能是由 anti-DIG-AP 中的沉淀引起 的:可以 通过短暂离心的方法除去。 注意:一些离心步骤可能引起一定材料的丢失,因 此应该 采用大量处理,来补偿这些损失。 参考文献订购信息联系方式和技术支 持 www.Roche-applied-science.com/support www.Roche-applied-science.com/support


相关文档

Southern Blot操作流程
BIO-RAD Mini Trans-blot中文说明书
Southern_Blot_Protocol
Southern blot
然科生物southern blot技术服务
Southern Blot原理及实验方法
Southern blot实验方法与步骤
southern blot 原理及试验方法
Southern blot(自总结2)
Southern blot--Current Protocol
电脑版