抗白色念珠菌IgY的稳定性与应用研究

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第 23 卷第 12 期 第              三 军 医 大 学 学 报 Vol. 23 , No. 12           2001 年 12 月 ACTA   ACADEMIAE   MEDICINAE   MILITARIS   TERTIAE Dec. 2001

论著

   

抗白色念珠菌 IgY 的稳定性与应用研究
常   ,张雅萍 ,肖光夏   ( 第三军医大学附属西南医院烧伤研究所 ,重庆 400038) 山

等体积完全福氏佐剂混合乳化 , 作抗原皮下注射免疫 25 周龄 Leghorn 鸡 ,水溶法 ( 蛋黄溶于 9 倍蒸馏水 ,离心取上清并用硫酸

  Abstract : Objective   To observe bio2activities and stability of egg immunoglobulin Y ( IgY) against Candida albicans . Methods  IgY was purified with simple water dilution method ( WD) from the eggs yolk of hens immunized with Candida albicans . The stabilities of IgY against acid , alkali , and heat were measured with ELISA. The effects of IgYon the growth of the bacterium and on its adhesion to cultured intestinal cells ( IEC2 6) were studied. Re sults   The minimal ELISA positive titer of IgY was 1∶ 800 and 61 % activity remained after pasteurization. The decrease of 12 IgY activity was not apparent at pH value from 710 to 310 , and 60 % activity remained after 150 min incubation at pH 719 and 37 ℃. IgY at 10 mg/ ml inhibited the growth of Candida albicans apparently and prevented the adhesion of the bacterium (105 cfu/ ml) to cultured intestinal cells and the DAO production. Conclusion   Egg yolk IgY against Candida albicans possesses its activities against Candida albicans in vitro , and shows sta2 ble properties to heat and acid or alkali environments.   Key words : egg yolk antibody ; IgY; Candida albicans

1  材料和方法

1. 1   抗白色念珠菌 IgY 抗体的制备

     : 目的   提 要 观察抗白色念珠菌鸡蛋黄抗体 IgY 的稳定性与体外生物学效应 。方法   用水溶法从免疫鸡蛋黄中提取抗白色 念珠菌抗体 IgY,ELISA 法检测抗体耐热 、 耐酸 、 耐碱的稳定性 , 观察 IgY 抑制白色念珠菌生长和抑制白色念珠菌粘附肠上皮细胞 ( IEC26) 。结果  IgY 在巴氏消毒后活性为对照的 61 % ,在 pH 710 至 310 酸性环境中活性改变不显著 ,在 pH 719 ,37 ℃ 作用 150 min 活性仍为对照的 60 % 。IgY 在 10 mg/ ml 时能明显抑制白色念珠菌生长和对肠上皮细胞的粘附 , 明显降低细胞上清二胺氧化酶 (DAO) 释放 。结论   鸡蛋黄抗体 IgY 具有高度稳定性和良好的体外生物学效应 。    关键词 : 鸡卵黄抗体 ; IgY; 白色念珠菌    中图法分类号 : R392. 1     文献标识码 : A

  免疫鸡蛋黄中含有大量来源于血清的 IgG 抗体 (又名 IgY) , 浓度远高于血清 , 且抗体提取简单 , 来源 十分丰富 ,近年来已引起了广大研究人员的兴趣 。同 时由于 IgY 的分子结构与哺乳类 IgG 的差异使 IgY 的 稳定性远高于哺乳类 IgG , 作检测试剂时因不激活补 体而比哺乳类 IgG 更精确 。本研究用白色念珠菌作为 抗原免疫产蛋鸡 ,从蛋黄中提取出抗白色念珠菌 IgY , 通过 ELISA 系统检测其耐热 、 耐酸 、 耐碱的稳定性 , 同 时观察了其抑制白色念珠菌生长和抑制白色念珠菌粘 附培养肠上皮细胞的生物学效应 , 为口服应用奠定 基础 。

钠沉淀 IgY) 分离纯化 IgY 并透析过滤除菌 。紫外光双波长测
   基金项目 : 重庆市科委 98 年院士基金资助项目 (980010)

CHANG Shan , ZHANG Ya2ping , XIAO Guang2xia ( Institute of Burn Research , Southwest Hospital , Third Military Medical University , Chongqing 400038 , China)
   作者简介 : 常   (1969 - ) ,男 , 重庆市人 , 硕士 , 主治医师 , 主要从事烧伤肠 山 源性感染的防治 , 现在解放军 47 医院外一科工作 。电话 : (028)
3016822

Stability and activities of immunoglobulin Y against Ca ndida albica ns IgY in vitro

1. 2  ELISA 检测 IgY 的效价 、 耐热 、 耐酸和耐碱稳定性

   收稿日期 :2001207204 ;修回日期 :2001210209

   白色念珠菌 ( CMCC 44104) 于 014 %福尔马林液中灭活后与

   效价 : 将 IgY 从 1 ∶ 倍比稀释至 1 ∶ 600 检测其效价 。 200 25 耐热 : 将提取 IgY 分别置于 25 、 、 、 、 、 、 ℃孵育 15 37 50 64 70 75 80 min 后稀释 5 000 倍进行 ELISA 检测 。耐酸 : 将 IgY 分别置于 pH 值为 1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 酸性环境中 37 ℃ 孵育 1 h 后稀释 5 000 倍 进行 ELISA 检测 。耐碱 : 将 IgY 置于 pH 719 的液体环境中 37 ℃ 分别孵育 30 、 、 、 、 min 后稀释 5 000 倍进行 ELISA 检 60 90 120 150 测 。ELISA 操作步骤 : 白色念珠菌包被 96 孔酶联板后依次加 入 : 处理后 IgY 稀释液 ( 每组 6 孔 ) ; 兔抗鸡 IgY 二抗 ; 最后加入 邻苯二胺底物显色 30 min ,并用一滴 2 mol/ L 硫酸终止反应 ,于 490 nm 比 色 ( 洗 涤 液 为 0. 05 % Tween220 , PH 714 0101 mol/ L PBS ,阳性对照分别为未加热 、 酸和碱处理的 IgY 稀释液 , 阴性 对照的一抗为未免疫鸡蛋黄提取物) 。

1. 3  IgY 的体外生物学效应

定 IgY 含量 ,SDS2PAGE 电泳检测提取 IgY 的纯度 , 细菌酶标染 色观察 IgY 结合白色念珠菌的特异性 。

文章编号 :100025404 (2001) 1221390203

  IgY 抑制白色念珠菌生长 : 实验分 2 组 : ① 对照组 :319 × 5 10 cfu/ ml 白色念珠菌液于 37 ℃ 恒温箱中孵育 , 于 6 、 、 、 h , 12 24 32 取样后活菌计数 。 ②IgY 拮抗组 : 将白色念珠菌 ( 319 ×105 cfu/ ml) 分别加入 IgY 10 、、15 mg/ ml ,于 6 、 、 、 h ,取样后活菌 5 2 12 24 32 计数 。   IgY 抑制白色念珠菌粘附培养肠上皮细胞 ( IEC26) : 将含白 色念珠菌 (5 × 5 cfu/ ml) 的 DMEM 培养液和含同浓度白色念珠 10 菌的 DMEM 培养液 ( 分别加入 IgY 10 、 、 15 mg/ ml 于 37 ℃ 5 2 孵 育预处理 30 min) 加入长满肠上皮细胞的 96 孔板 、 每时相点设

第 12 期                 ,等 . 抗白色念珠菌 IgY 的稳定性与应用研究                常 山 1391
6 平行孔 。观察时相点为 : 加入白色念珠菌后 30 、 、 、 、 60 90 120 150 min 。检测指标与方法 : ① 粘附细菌数 : 将各个时相点的培 养孔去除上清 ,10 mmol/ L pH 7. 4 PBS 冲洗培养孔 6 次 ( 每次 200 μ 孔) ,然后加入 0125 %胰蛋白酶20102 %EDTA 消化液 100 l/ μ 孔消化约 2 min 后接种于沙氏平板培养 72 h 后活菌计数 。 l/ ② 上清液二胺氧化酶 (DAO) : 012 mol/ L pH 712 的 PB 液 115 ml + 二甲基联苯胺 50μ + 尸胺底物溶液 50μ + 样本 250μ + l l l 辣根过氧化物酶 50 μ 共计 119 ml 置于 37 ℃ l 水浴 30 min 于 436 nm 比色 。检测时相点为粘附后 60 min 。

1. 4   统计学处理
   采用 t 检验 。

2    结 果

图2  不同 pH 下 IgY 抗体活性变化 Fig 2  IgY activities at different pH values

2. 1  IgY 特异性 、 含量和纯度

2. 2  IgY 效价和稳定性

   效价 : ELISA 检测出蛋黄 IgY 效价为 1 ∶ 800 , 而血清 IgG 12 效价为 1∶ 400 。耐热 : 以温度为横轴 ,以吸光值为纵轴 ,各温度 6 处理后的吸光值形成一曲线 ( 阳性对照 D490 值为 11841) , 见图 1 。曲线表明在 25~64 ℃ 作用后 IgY 的活性下降缓慢 ,64 ℃ 作 用 15 min 后活性为对照的 61 % 。64 ℃ 以上作用 15 min 后 IgY 活性迅速下降 。耐酸 : 以 pH 值为横轴 ,以吸光值为纵轴作一光 滑曲线 ( 阳性对照 D490 值为 01827) ,取阴性对照 D490 值 0124 为 纵轴原点 ,见图 2 。曲线表明 IgY 在 pH 值为 3 以上时其活性改 变不大 ,在 pH 值等于 3 时其活性为阳性对照的 70 %以上 ,但在 pH 值为 3 以下时其活性迅速下降 。耐碱 : 以时间为横轴 ,以吸 光值为纵轴作一光滑曲线 , 取阴性对照 D490 值 01201 为纵轴原 点 , 作用时间为 0 的 D490 值为阳性对照 D490 值 ,见图 3 。曲线 表明 IgY 在 37 ℃ 值 719 碱性环境中 , 其活性随时间延长下 pH 降缓慢 ,在作用时间为 150 min 后其活性接近阳性对照的 60 % 。

2. 3  IgY 的体外生物学效应

   抑制白色念珠菌生长 : 白色念珠菌正常生长量和不同浓度 IgY 作用下生长量见表 1 , 结果表明白色念珠菌在 24 h 内为对 数生长期 ,24 h 后进入生长平稳期 ,加入不同浓度 IgY 后白色念 珠菌的生长受到一定程度的抑制 ,在 IgY 浓度为 10 mg/ ml 时抑 制作用最明显且抑制时间最长 。

   抗白色念珠菌 IgY 对该菌染色阳性而对绿脓杆菌 ,葡萄球 菌染色阴性 。提取物 IgY 含量平均为 1317 mg/ ml 蛋黄液 。将 SDS2PAGE 电泳凝胶扫描 ,检测 180 × 3 带 ( IgY) 所占百分比 ,得 10 出 IgY 纯度高达 95 % 。
图1  不同温度下 IgY 抗体活性变化 Fig 1  IgY activities at different temperatures

   抑制白色念珠菌粘附肠上皮细胞 : 白色念珠菌和加入不同 浓度 IgY 处理后 ,于各时相点粘附培养肠上皮细胞菌量见表 2 。 60 min 上清二胺氧化酶 DAO 见图 4 。结果表明 : 白色念珠菌粘 附肠上皮细胞高峰在 60 min ,不同浓度 IgY 均能抑制白色念珠 菌的粘附 ,在 IgY 浓度为 10 mg/ ml 时抑制作用最明显且抑制时 间最长 。
表 1  IgY 对白色念珠菌生长的影响( × 5cfu/ ml) 10 Tab 1  Effects of IgY on the growth of Candida albicans ( × 5cfu/ ml) 10
Control IgY 2. 5 mg/ ml IgY 5 mg/ ml IgY 10 mg/ ml 6h 5. 4 ± 7 1. 3. 4 ± 2 1. 12 h 136 ± 26 24 h 332 ± 44 32 h 339 ± 36 321 ± 18 341 ± 28 249 ± 67

3 : P < 0. 05 , 3 3 : P < 0. 01 vs adhesion control 图 4  IgY 处理后细胞培养上清 DAO 的含量 Fig 4   Amount of DAO in the culture supernatant of ICE 6 with IgY treatment 2

图 3   719 37 ℃ IgY 抗体活性变化 pH 下 Fig 3  IgY activities at pH 719 and 37 ℃ 3 : P < 0105 , 33 : P < 0101 vs control
1. 8 ± 1 3 1. 2. 0 ± 3 2 90 ± 5 3 9. 65 ± 33 15 57 ± 33 13 288 ± 3 52 278 ± 30 219 ± 3 36

第 三 军 医 大 学 学 报 第 139                                                23 卷 2
表 2  IgY 对白色念珠菌粘附肠上皮细胞( IEC26) 的影响( × 5cfu/ ml) 10 Tab 2  Effects of IgY on the adhesion of Candida albicans to intestinal epithelial cells ( IEC26) ( × 5 cfu/ ml) 10
30 min 60 min 90 min 120 min Control 910 ± 188 390 ± 136 3 400 ± 750 2 410 ± 491 2 190 ± 416 2 450 ± 478 2 190 ± 735 1 720 ± 797 1 660 ± 681 IgY 10 mg/ ml IgY 5 mg/ ml 600 ± 105 480 ± 117 1 760 IgY 215 mg/ ml

3  讨论

   目前 IgY 已经引起广大研究人员的兴趣 , 它主要 有三个特性 : ① 产量大提取简便 ② 具有高度的稳定性 和生物效应 ③ 作为诊断试剂干扰小 。    本研究应用简便水溶法提取 IgY 的产量高达 1317 mg/ ml 蛋黄液 ,纯度高达 95 % ,ELISA 滴度在 1∶ 800 , 12 且 IgY 只对白色念珠菌染色阳性 , 对绿脓杆菌和葡萄 球菌染色均阴性 , 表明 IgY 来源丰富 、 纯化简便 、 具有 较好的特异性 ,是一种具有很高研究和应用价值的抗 体。    既往有学者采用抗体中和滴度法检测 IgY 的稳定 性 ,发现其具有良好的耐酸 ,耐热的理化性质 。本研究 首次采用敏感的 ELISA 法对 IgY 的稳定性进行系统研 究发现 IgY 具有高度的稳定性 。IgY 能耐受巴氏消毒 ( 63 ℃ 15 min) ,能耐受 37 ℃、 值 3 以上的酸性环境 pH 1 h ,能耐受 37 ℃、 719 碱性环境 150 min 。37 ℃、 pH pH 值 3 为通常状况下胃环境 ,37 ℃、 719 为通常状况 pH 下肠道环境 . 因此上述结果表明 IgY 能够通过食品工 业中常用的巴氏消毒法 , 口服后有望能在消化道保持 高活性 。这种稳定的理化性质对 IgY 作为口服药物和 诊断试剂都是十分有利和必要的 。IgY 优良的稳定性 可能与其分子结构有关 : IgY 氨基酸及含糖量与哺乳 类 IgG 有明显差异 , 其分子结构虽仍然为 2H + 2L , 但 它与哺乳类 IgG 最大区别是 IgG 的 Fc 段缺少 IgY 的第 2 恒定区 ( C2 ) 而代之以 IgG 出现了一个铰链区 ( Hinge region) ,而二者的抗原结合部位 F ( ab) 尚未发现明显不 同 。在某些鸡蛋黄中天然含有 IgY 的 △ 片段 , 而这 Fc 种 △ 片段比完整的 IgY 具有更高的稳定性 。上述事 Fc 实说明 IgY Fc 段结构变化对其活性有明显影响 。    本实验中 IgY 体外能明显抑制白色念珠菌生长 , 抑制强度和时间与浓度呈量效关系 。筛选出的 IgY 浓 度 ( 10 mg/ ml ) 能明显抑制细菌生长达 24 h , 而前 24 h 正是该菌的对数生长期 , 表明 IgY 具有良好的抑菌效 果 。同时在该浓度下 IgY 在各时相点能明显抑制白色 念珠菌对培养肠上皮细胞的粘附 , 其抑制效果同样具

3 : P < 0105 , 33 : P < 0101 vs control

1 630 ± 3 913

560 ± 33 219

± 33 642

420 ± 33 116

790 ± 33 145

有量效关系 。IgY 抗体抑制白色念珠菌生长主要机制 可能为抗体封闭白色念珠菌表面抗原 , 防止白色念珠 菌向菌丝体转变 ; 引起凝集等 。同时白色念珠菌是典 型的粘附致病菌 ,特别在肠道 ,白色念珠菌感染的首要 条件是通过菌体表面抗原粘附在肠上皮细胞上 , 因而 抗体封闭菌体表面抗原对防止白色念珠菌感染将起到 重要作用 。二胺氧化酶 (DAO) 是一种控制肠粘膜增殖 的细胞质酶 ,主要存在于哺乳动物肠上皮细胞内 。肠 上皮细胞受损时 ,其细胞内 DAO 下降 ,而上清 DAO 明 显升高 。因此 DAO 已成为反映肠上皮细胞因缺血和 感染而受损的重要敏感指标 。本实验应用 IgY 处理白 色念珠菌后 ,在粘附高峰明显降低了肠上皮细胞 DAO 的释放 ,保护了细胞免受白色念珠菌的破坏 。IgY 抑 制白色念珠菌生长 、 抑制其粘附肠上皮细胞的结果表 明该抗体不仅具有良好的稳定性和特异性 , 还具有高 度的生物学活性和高度结合抗原的能力 。   目前已成功提取出抗蛋白质 、 病毒 、 细菌的 IgY , 并发现其具有良好的抗病毒抗细菌的生物学效应 , 用 于口服防治肠道病原体已取得良好效果 。本研究制备 出抗白色念珠菌 IgY , 发现该抗体产量高 , 稳定性极 好 ,具有很好的生物学效应 ,作为口服药物或食品添加 剂预防和治疗病原性腹泻和肠源性感染将具有广阔的 前景 。 参考文献 :
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( 编辑   陈聪连)


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