NK细胞的生物学及在肿瘤治疗中的作用

综述 NK 细胞的生物学及在肿瘤治疗中的作用 自然杀伤细胞(natural killer cell,NK 细胞)是一种骨髓衍化的淋巴细胞,由于在形态 上胞浆丰富,胞质内含有大型嗜天青颗粒,故又称为大颗粒淋巴细胞(large granular lymphocyte,LGL)[1,2]。1971 年 Cudkowizc 和 Bennett 首次描述了这类细胞的功能,他们 发现经放射线照射的小鼠接受母体来源的骨髓细胞移植后发生了排斥反应[3,4]。传统理论认 为,移植抗原是共显性遗传的,例如,亲代抗原在第一代杂种共表达,子代能够耐受亲代的 主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)[3]。然而,Cudkowizc 和 Bennett 发现 H-2 基因杂合体的第一代杂种鼠经放射线照射后能够排斥亲代 H-2 基因纯合体 小鼠的骨髓细胞。这种现象被称为“杂交抵抗” 。后来发现介导这种现象的细胞是一种淋巴 样细胞,对放射线不敏感,能在体外直接杀伤肿瘤细胞,且无 MHC 限制性[1,5-7]。随后就将 这类细胞命名为 NK 细胞。与 T、B 细胞免疫激活过程不同,NK 细胞的免疫反应是迅速的, 意味着其可在感染最初阶段清除病原体。事实上,众多研究已表明,NK 细胞可以清除胞内 菌和寄生虫感染,在控制一些病毒感染的过程中也起重要作用[8-11]。尽管一些体内外试验表 明,NK 细胞具有抗肿瘤活性,但是其确切机制还不完全清楚[12-14]。 1. NK 细胞的生物学特征 NK 细胞占外周血淋巴细胞的 10-15%,也存在于脾脏、骨髓及其它组织,包括肝脏、 腹腔、胎盘[1]。NK 细胞在肿瘤和病毒感染中发挥很重要的免疫监视作用,构成机体免疫系 统第一道防线。与免疫系统其它细胞(尤其是 T 细胞)不同,NK 细胞不能被抗原重复刺激 致敏而且没有长期的抗原记忆功能。NK 细胞缺乏特异性的细胞表面分子标志,许多标志认 为是 NK 相对特异性的,比如小鼠 NK 细胞表面的 NK1.1、 DX-5、ASGM1,人类 NK 细胞 表面的 CD56, CD16[1,15-18]。 但是这些表面分子在某些 T 细胞亚群和其它类型细胞也有表达。 因此,NK 细胞被定义为表达上述分子标志,同时不表达 T 细胞特异性标志如 CD3、CD4, 也不表达特异性的抗原识别受体(TCR 或 BCR)[1,6]。作为一种先天性免疫分子,NK 细胞 无需识别经典的 MHC 分子,其发挥细胞毒效应主要通过释放穿孔素/颗粒酶途径,也可以 通过 Fas 配体(FasL)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)杀伤靶细胞[19]。NK 细胞活化后还可以分泌多种细胞因 子, 包括 γ 干扰素 (gamma interferon , IFN-γ) 肿瘤坏死因子 、 (tumor necrosis factor , TNF) 、 粒 细 胞 - 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 ( granulocyte-macrophage colony stimulating factor , GM-CSF) 、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor ,G-CSF)等[18,20-22]。 这些细胞因子可以抑制或促进造血作用,参与病毒感染后的早期免疫应答和迟发性 T 细胞 介导的免疫应答。在 NK 细胞自身的发育、分化中,一些细胞因子发挥着重要的作用。白介 素(Interleukin,IL)-2、IL-15、IL-21 三种细胞因子共享 IL-2 受体(IL-2R)γ 链,能够诱 导 NK 细胞活化和增殖,然而只有 IL-15 在 NK 细胞的发育过程中起关键作用[23-26]。与 IL-2 缺陷鼠不同,在 IL-15 基因敲除鼠中缺乏功能性的成熟 NK 细胞[25,26]。将成熟 NK 细胞输注 IL-15 基因敲除鼠中仅能存活数天,而输注正常小鼠却能长时间存活,证明 IL-15 为 NK 细 胞提供了关键性的生存信号[27]。与 T 细胞在胸腺中发育不同,骨髓是 NK 细胞发育的场所 [23,28,29] 。 这并不意味 NK 细胞和 T 细胞在分化上完全独立, 已有研究表明, 胸腺中存在 NK/T 细胞的共同前体细胞,提示 NK 细胞和 T 细胞为个体发育上关系十分接近的两类细胞[30]。 另外,细胞因子也可调节 NK 细胞的功能。IL-12 和 IFN-α/β 能对 NK 细胞发挥有效的刺激 效应,联合应用 IL-12 和 IL-18 能显著提升 NK 细胞的功能[6,31]。NK 细胞活化过程中 IL-2 也起重要作用[1,32]。 2. “丢失自我”假说

1985 年,Ljunggren 和 Karre 发现,与 MHC 依赖性的 T 细胞免疫反应不同,NK 细胞 可以杀死不表达 MHC-I 类分子的肿瘤细胞,进而提出“丢失自我”假说[33]。该假说认为, 细胞免疫应答中 T 细胞和 NK 细胞是相互补充的两个方面:初始 T 细胞表面的 TCR 与靶细 胞表面的抗原肽:MHC 分子复合物特异结合后被活化;相反,NK 细胞能杀伤不表达 MHC-I 类分子的靶细胞,一旦识别 MHC-I 类分子就产生杀伤抑制性信号[34]。研究者发现,一种不 表达鼠 MHC 分子 H-2 的鼠白血病细胞易被 NK 细胞杀死, 而正常表达 H-2 的白血病细胞则 [35] 不能被 NK 细胞杀死 。同时也发现人 NK 细胞可以清除不表达 MHC-I 类分子的类淋巴母 细胞系[36]。有趣的是,H-2 缺陷鼠白血病细胞转染了 H-2 基因,或者人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-1 缺陷的类淋巴母细胞转染了 HLA-1 基因后,又分别恢复了对 NK 细胞的杀伤不敏感性[36,37]。 但是, “丢失自我”假说不能解释所有现象,并非所有表达 MHC-I 类分子的细胞可以避 免 NK 细胞的杀伤,NK 细胞也不能杀伤所有 MHC-I 缺陷的细胞。有研究表明,NK 细胞不 能排斥 MHC-I 缺陷的非造血系统组织,如皮肤移植物。该研究应用一种突变鼠,该鼠由于 β2 微球蛋白基因突变不能表达正常 β2 微球蛋白,不能形成 MHC-I 类分子的轻链,故缺乏功 能性 MHC-I 类分子的表达,NK 细胞不能有效排斥该突变鼠来源的皮肤移植物[38]。另有研 究表明,自体 NK 细胞可以杀死一些表达 MHC-I 的病毒感染细胞,并且经 IL-2 活化后,还 “丢失自我”假说仅仅是 NK 细胞识别 可以杀死一些 NK 细胞不敏感的靶细胞[39,40]。因而, 靶细胞一种解释。 3. NK 细胞受体 NK 细胞能杀伤肿瘤细胞和病毒感染靶细胞,对正常自身细胞无细胞毒作用,表明它们 一定具有能够识别正常自身组织细胞和异常体内组织细胞的能力。研究发现,NK 细胞表面 具有两种不同的受体,分别是活化和抑制性受体。NK 细胞通过表面活化受体与自身组织细 胞、病毒感染细胞和某些肿瘤细胞表面相应糖类配体结合,可经活化信号转导途径,产生杀 伤作用;通过表面杀伤抑制受体与细胞表面 MHC-I 类分子结合,可产生杀伤抑制信号,抑 制其杀伤功能。因而,NK 细胞受这两种受体的调控,正常情况下处于一种平衡状态,当一 些因素破坏了这种平衡, 使活化或抑制性受体占主导地位, NK 细胞分别产生杀伤或杀伤 则 [41] 抑制作用 。 3.1 NK 细胞抑制性受体 第一类抑制性受体首先在啮齿类动物中发现,名为 Ly49 受体,可直接与经典的 MHC-I 类分子结合[42-49]。 B6 鼠体内发现超过 10 种不同的 Ly49 受体, 在 其中有 8 种是抑制性的[50-52]。 在人体内仅发现一种类似 Ly49 的无功能性的基因片段[53,54]。第二类是杀伤细胞免疫球蛋白 样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)家族,仅在灵长类动物中出现,啮齿 类动物中没有,也能直接与经典的 MHC-I 类分子结合[55-60]。大多数人体内存在 10 种不同的 KIR 基因,且并不全都是抑制性的 [61-64] 。第三类在灵长类和啮齿类动物中均存在,由 CD94/NKG2 异二 聚 体 构成 [65-68] 。 一 些 NKG2 亚 型 能 共 享 CD94 的 一 段链 , 但 仅 有 CD94/NKG2A 是抑制性的。CD94/NKG2 受体能识别经典 MHC-I 类分子先导序列,这种先导 序列先与非经典 MHC-I 类分子(包括 HLA-E 分子和鼠 Qa-1 分子)结合后形成复合物,再与 抑制性受体 CD94/NKG2A 相结合[69-71]。 这种直接或间接识别经典 I 类分子的方式可能在抑制 NK 细胞功能方面互为补充(图 1)。但是并非所有经典 I 类分子包含这种先导序列,能够被 HLA-E/Qa-1 识别,也并非所有经典 I 类分子能直接被 KIR/Ly49 识别[72,73]。 这些抑制性受体一个非常重要的特征,就是在 NK 细胞亚群表面共表达或部分共表达, 细胞表面表达多种受体构成了 NK 细胞独特的受体库。 这种受体表达的多变模式允许 NK 细 胞能识别表达不同 MHC-I 类分子的细胞。例如,下调自身 MHC-I 类分子的宿主细胞能被 NK 细胞识别杀伤,如果完全缺乏 MHC-I 类分子的表达,则 NK 细胞的杀伤作用更加明显。

对肿瘤细胞和病毒感染细胞的研究也证实了这一点,因为它们部分或全部缺乏 MHC-I 类分 子的表达[74,75]。 这三类受体通过胞浆区的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIM)转导信号,可活化 SHP 磷酸酶,抑制酪氨酸磷酸化,传递抑制性信
[76-78]





图 1:NK 细胞能直接或间接识别经典 MHC-I 类分子。
3.2 NK细胞活化性受体

多年以来,对 NK 细胞活化受体的认识一直落后于抑制性受体,在此期间,认为一些粘 附分子或共刺激分子,如淋巴细胞功能相关抗原(lymphocyte function associated antigen, LFA)-1,与 NK 细胞的活化有关[79]。直到最近,陆续发现了一些与 NK 细胞活化有关的受 体,才真正关注 NK 细胞发挥天然杀伤作用过程中的分子机制。 NKp46, NKp30, and NKp44代表第一类活化性受体,它们属于免疫球蛋白超家族,统称为天 然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptors,NCR)[80]。其中NKp46和NKp30在静止的和 活化性NK细胞表面表达, NKp44仅在活化性NK细胞表面表达[81-83]。 单克隆抗体 (monoclonal antibodies,mAbs)封闭NCR后可不同程度的阻断NK细胞杀伤多种肿瘤细胞的能力,如果同 时封闭这三种NCR,某些肿瘤能完全逃避NK细胞的识别杀伤作用[84]。NKp46是NCR中唯一 与人NK细胞杀伤鼠源性靶细胞过程相关的受体,相应地在鼠体内检测到NKp46的类似物。 NCR与转导衔接蛋白的不同信号分子相互配对,包括CD3ζ、FcεRIγ、KARAP/DAP12[85-87]。 NKG2D 是另一类 NK 细胞表面活化受体, 属于 NKG2 家族成员, 可识别非经典的 MHC [88] I 类相关基因(MHC class I chain,MIC) ,包括 MIC-A 和 MIC-B 。MICA 和 MICB 不表 达 β2 微球蛋白,在应激状态下可上调表达,且多表达于上皮性肿瘤细胞表面,包括乳腺、 卵巢、结肠、肾、肺癌等组织[89,90]。近来研究表明,ULBP(UL16-binding protein,UL16 结 合蛋白)是 NKG2D 的另一种配体[91]。这两种配体都存在于人类细胞表面,NKG2D 还可以 识别另一种存在于鼠类细胞表面的配体 RAE-1 (retinoic acid early inducible 1) 正常情况下, , B6 鼠可排斥表达 RAE-1 抗原的肿瘤细胞 RMA,一旦用抗 NK1.1 单抗清除鼠体内 NK 细胞 后,则不能排斥表达 RAE-1 抗原的 RMA 细胞[92]。与 NKG2 家族其它成员不同,NKG2D 不

与 CD94 形成异二聚体结构,与 NKG2A、NKG2C、NKG2E 相比并没有更多的同源性区域 结合于 CD94[93]。 另外一些活化性受体, 包括 KIR 家族中的 KIR2DS 和 KIR3DS, NKG2 家族中的 NKG2C、 NKG2E,Ly49 家族中的 Ly49D 和 Ly49H,这些受体均能识别 MHC-I 类的配体[65,94-98]。还 有一些所谓的复合型受体,如 2B4 和 NKp80,与其它触发性受体结合后能诱导 NK 细胞杀 伤靶细胞的能力[99,100]。 4. NK 细胞的抗肿瘤作用: NK 细胞可以浸润到肿瘤局部,阻止肿瘤的扩散。例如 NK 细胞浸润与早期胃癌、减少 转移和淋巴浸润相关[101]。尽管有以上的相关作用,也有很多关于体外和动物试验的相关文 献报导,NK 细胞在临床上的治疗作用仍然有待进一步研究。这些临床前期研究是大量正在 进行或已经完成的临床实验的理论基础, 肿瘤动物模型试验已经被广泛用来研究 NK 细胞的 抗肿瘤活性。例如,Divino 等发现,以腺病毒为载体,转染 IL-12 基因到乳腺癌肝转移小鼠 模型体内,可显著提高生存率,其中 40%出现肿瘤完全消退[102]。应用单抗清除体内 NK 细 胞,此抗肿瘤作用消失,IL-12 被认为可能是促进了 NK 细胞介导的细胞毒性及 IFN-γ 的分 泌。最近研究发现 NK 细胞的功能与其定居部位可能存在一定的关系,如肝脏的 NK 细胞可 以表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL) 而外周血和脾脏 NK 细胞不表达 TRAIL。 , 目前认为 TRAIL 是一种跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(TNF)家族,可以诱导很多异常细 胞的凋亡,但是不能诱导正常细胞凋亡。IFN-γ 缺陷鼠的肝脏 NK 细胞不表达 TRAIL,而且 TRAIL 与控制肿瘤细胞(表达能结合 TRAIL 的特异性受体)肝转移密切相关[103]。 一些研究显示,NK 细胞可能与其它免疫效应细胞和分子互相影响发挥十分复杂的抗肿 瘤作用。Tanaka 等研究了 IL-18 在减小荷瘤鼠肿瘤体积过程中的可能作用机制,他们发现, 清除 NK 细胞,IL-18 的此种作用消失[104]。他们将 IL-18、NK 细胞、骨髓来源的树突状细 胞、初始 T 细胞、肝癌细胞体外共培养,研究 NK 细胞在免疫反应中的作用机制。结果发 现,IL-18 可以刺激 NK 细胞杀伤肿瘤细胞的作用, 同时诱导了细胞毒性 T 细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL) 。肿瘤特异性 CTL 的诱导作用依赖于 IL-18,且与 NK 细胞和树突状细 胞相互接触密切相关。 因此认为, 树突状细胞和 NK 细胞的相互作用可能促进了体内免疫记 忆的功能。 免疫治疗作为一种方法应用于肿瘤病人, 应考虑到患者机体免疫系统的完整性问题。 例 如,CD3ζ 是 NK 细胞和 T 细胞中转导跨膜信号的成员之一,肿瘤患者及荷瘤鼠体内 CD3ζ 表达量下降[105-108]。肿瘤化疗是通过直接抑制免疫效应细胞功能或分泌细胞因子来最大限度 的抑制免疫反应, 但是 NK 细胞抗肿瘤作用的某些机制可能是特异性的。 人黑色素瘤细胞分 泌巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration-inhibitory factor,MIF),可以直接抑制 NK 细胞的杀伤毒性。在慢性粒细胞白血病(chronic myelogeneous leukemia,CML)研究方面, 一些实验室报导随疾病进展伴随 NK 细胞功能降低和细胞数量的减少[109-112]。BCR/ABL 基 因产物直接影响了 NK 细胞的分化[113]。以上结果也许可以解释 CML 患者自体骨髓移植后, 应用 IL-2 和活化 NK 细胞,疗效甚微。 有少数资料认为 NK 细胞抑制性受体与肿瘤形成有关, 但这方面研究的困难在于 NK 细 胞受体表达与 MHC-I 类分子没有直接关联。在临床上应用单倍体干细胞移植的病人中,供 者 NK 细胞的 KIR 与受者 MHC-I 类抗原不匹配, 可引起移植排斥反应[114]。 由于 NK 细胞表 面受体类型的多样性, 真正了解 NK 细胞的抗肿瘤机制尚有待于对所有受体-配体的研究和 供者-受者之间 NK 细胞受体类型的分析。 Koh 等报导了更多关于 NK 细胞抑制性受体与肿瘤形成相关的实验资料[115]。在小鼠模 + 型上,5E6 抗体的 F(ab/)2 片段可以封闭 NK 细胞抑制性受体,如 Ly49C 和 Ly49I。5E6 NK 细胞占小鼠 NK 细胞总数的 35-60%,体外实验表明,由于 C1498 白血病细胞和 EL4 淋巴瘤

细胞表达 Ly49C/I 特异性配体 H2b,对 5E6 NK 细胞的杀伤作用不敏感,但是如果特异性阻 断 NK 细胞表面 Ly49C/I 受体表达,则可明显提高 NK 细胞的杀伤活性。向小鼠输注 C1498 细胞后全部死亡,肝脏、骨髓、中枢神经系统都有肿瘤细胞累及,应用含 F(ab/)2 片段的 5E6 抗体封闭 Ly49C/I 受体后治疗组存活率显著性增加,接种后 120 天,有 1/4 小鼠没有肿瘤形 成。这个实验第一次发现封闭 NK 细胞抑制性受体可以发挥 NK 细胞体内抗肿瘤的效应,为 临床上应用 NK 细胞治疗疾病开拓了一个新的可能途径。 NK 细胞可直接参与杀伤细胞作用, 但是关于 NK 细胞在体内的重要生理功能还不清楚, 可能与其分泌的细胞因子有关。在一定的刺激下,NK 细胞可以分泌较高浓度的 TNF 和 IFN-γ[116-119]。IL-12 通过激活信号传导子及转录激活因子 4(signal transducer and activator of transcription factor 4 ,STAT4)途径促进 IFN-γ 分泌[120]。IL-18 通过 IL-1 受体相关蛋白(IL-1 Rrp)也能促进 IFN-γ 分泌,敲除 IL-1 Rrp 基因的小鼠对 IL-18 无应答反应,同时其体内的 NK 细胞也不表现杀伤和 IFN-γ 分泌活性[121]。给小鼠联合应用 IL-12 和 IL-18 可导致 IFN-γ 介导的致命性炎症反应, 但是在清除小鼠体内 NK 细胞或对 STAT4 缺陷小鼠联合应用 IL-12 和 IL-18,则这一致炎作用就消失了[122]。 NK 细胞分泌的 IFN 和其它细胞因子在杀伤肿瘤细胞方面可能发挥了很大的作用。 用一 种持续表达 Fas 受体但是对于 Fas 介导的体外杀伤活性不敏感的肾细胞癌细胞系输注小鼠体 内,观察到有 IFN-γ 依赖性的肿瘤延迟生长和存活时间延长[123]。细胞因子可以通过这种方 式影响肿瘤细胞归巢和细胞毒性。IL-12 和 IL-2 可诱导 NK 细胞向肝脏聚集,但是在 IFN-γ 基因缺陷小鼠或用抗体封闭血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)后,这种 NK 细胞的趋化作用消失[124]。因此研究这些复杂的细胞因子间的相互 作用及最近发现的趋化因子对 NK 细胞的趋化作用, 将有助于了解如何操纵体内 NK 细胞的 [125,126] 作用 。 应用活化 NK 细胞治疗肿瘤可追溯到上世纪 80 年代,早期的临床试验着重于晚期转移 性实体瘤的病人。 IL-2 单用或联合活化的 NK 细胞治疗的病例中, 在 虽然有 20-30%反应率, 仍然认为对大部分肿瘤的整体临床疗效不理想。也有资料表明,肿瘤病人皮下注射 IL-2 激 活内源性 NK 细胞的活性是安全可行的一种治疗方案[127-130]。美国学者发现向自体移植后的 病人皮下注射 IL-2 扩增体内 NK 细胞后,病情得到缓解。目前的观点认为低剂量 IL-2 可以 促进骨髓前体细胞分化为 NK 细胞及 IL-2 依赖性的 NK 细胞寿命延长[131]。但是进一步研究 发现,输注体外 IL-2 活化的 NK 细胞联合应用低剂量 IL-2 皮下注射,虽然也可以提高 NK 细胞体内杀瘤活性, 促进炎性细胞因子的释放, 但是对自体移植后淋巴瘤和乳腺癌的治疗效 果不明显,主要的问题可能在于 NK 细胞的杀伤活性不具有特异性,因而今后以 NK 细胞为 基础的免疫疗法也许应该提高其治疗的特异性[132]。 抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC) 可能增加了 NK 细胞特异性识别和杀伤靶细胞的能力,例如,曲妥单抗(Transtuzumab,抗 HER2/neu 的人源化抗体)可以显著增加未经 IL-2 活化的 NK 细胞杀伤乳腺癌细胞的活性 [133,134] 。最近在体乳腺癌模型实验表明,ADCC 是清除肿瘤细胞的机制之一,使用单克隆抗 体或重组抗体将会提高 NK 细胞杀伤肿瘤的特异性[135-137]。 DIS-9 (谵妄)


· After “No Response”; Fifth column: “Reevaluate cause of delirium” was added. DIS-12 (Adjustment Disorder) · After the “Danger to self and others” pathway: The following bullets were added, “Consider psychiatric consultation,” “Increase Monitoring,”

Consider removing sharp objects”. DIS-15 (Substance-Related Disorder/Abuse) · History of abuse pathway: “Monitor for signs and symptoms of relapse”. 正如 Klingemann 所言,应用 NK 细胞进行免疫治疗还需要大量试验证据,只能看作是 肿瘤综合治疗的一部分,不能代替传统治疗方法,应当与其它治疗方法联合应用,协同发挥 作用[138]。


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