Southern blot(自总结2)

Southern blot
1. 提取植物总 提取植物总DNA (CTAB法) 法
试剂: 试剂

(J 版)

1) 2×CTAB 提取缓冲液(低于 15℃会析出,加入材料前先 65℃预热) 0.1 mol/L 1.4 mol/L 20 mmol/L 20 g/L 20g/L Tris-Cl (pH 8.0) NaCl EDTA (pH 8.0) CTAB (2%) PVP-40(2%)

使用前加入2% (体积比) 的巯基乙醇。

步骤: 步骤 1) 提取前将植物材料在暗处放置24小时,以降低材料的淀粉含量。 2) 剪取大约1g 叶片,置于研钵中,倒入液氮研成粉末(一定研磨细致,非常重要),分装 入2ml离心管中(样品约占0.5ml的体积),每管加入900ulCTAB提取缓冲液,温和彻底 的混匀,静置,使裂解彻底。 3) 65℃水浴保温 1-1.5 小时。 4) 冷至室温后加 900ul 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),充分温和混匀直到叶片粉末由绿 转白(水相,酚相混匀成乳状液)。 5) 室温下 13,000 rpm 离心 10 min,吸取上层水相。 6) 取上清(约 900ul)再用等体积的 氯仿:异戊醇 (24:1)再抽提一次。 心 10min。 7) 取上层水相(约 700ul),加入 2 倍体积无水乙醇沉淀 DNA。小心倒出每管中液体,将 絮状 DNA 沉淀收集到一个新的 1.5ml EP 管中(同一个样品)。 8) 用 70%乙醇洗涤沉淀 3-5 次,每次将沉淀适当浸泡以充分洗涤,最后一次稍加离心,将 洗涤液尽量去除干净,通风橱中晾干约 10min 左右(不要过分干燥)。 13,000 rpm 离

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9) 加 200ul 灭菌的去离子水(或者 TE),并加入 2ul Rnase A(10mg/ml), 37℃保温 3060min 溶解沉淀,充分混匀,并消化 RNA。(可直接到第 11 步) ( 10) (可省步骤)如需做此步骤,则上步中需用 700ul ddH2O 溶解沉淀,37℃保温消化 RNA 后再用等体积氯仿:异戊醇 (24:1)抽提,并离心,取上清。 加入 1/10 体积的 NaAC(3M,pH5.2)和 2-2.5 倍体积的无水乙醇,-20℃沉淀 30min1hr,10000rpm 离心 10 分钟。 70%乙醇洗涤沉淀 3-5 次,干燥,用 200ulTE 溶解沉淀,4℃溶解过夜。 11) 取 2ul 走 0.7%的琼脂糖凝胶,检测所提 DNA 的质量。(上样 DNA 需要充分混匀) 12) 电泳同时可用紫外分光光度计测量 DNA 的纯度,浓度(仅参考)。 13) 选取有代表性的 2-3 个 DNA 样品(即电泳显示浓度最大和最小的样品),稀释 10 倍后 用精定量 marker 进行电泳定量。 A260/A280=1.8 A260/A230=2-2.5

2. 制备地高辛标记探针 制备地高辛标记探针(详见 kitII P9)
试剂: 试剂: double distilled water(ddH2O):稀释 DNA EDTA(0.2M, pH8.0 ):终止标记反应 DIG-High Prime (kit):瓶 1,防止反复冻融(-20℃保存)

A. 目的基因探针标记 随机引物法):20ul 体系 目的基因探针标记(随机引物法 随机引物法 (1) 1ug (至少 300ng)模板 DNA,用无菌 ddH2O 稀释到 16ul。 (2) 沸水浴煮 10min,立即放入冰中。 (3) 混匀 DIG-High Prime (瓶 1),加 4ul 到变性 DNA 中,混匀,稍加离心。 (4) 37 ℃反应过夜(约 20 小时)。 (5) 加入 2ul 0.2M EDTA(Ph8.0)或 65℃ 10min 终止反应。

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B. Marker 探针标记 (随机引物法 : 随机引物法): 随机引物法 取 3ug λDNA/HindIII Marker,用无菌水将体积补到 16ul,沸水浴中煮 10min,立即放入 冰中。其他同上。

探针标记效率的评估(对探针定量):(Kit P12) 探针标记效率的评估(对探针定量):( ) 试剂: 试剂: Washing buffer:洗去未杂交的抗体 马来酸 buffer:稀释封闭液 检测 buffer(pH9.5):调节 pH 值 10×Blocking solution(kit ,瓶 6) :用马来酸 buffer 稀释到 1×。(现配现用) Antibody solution(kit):每次使用前需要将 anti-digoxigenin-AP(瓶 4)以 ( ) 10000rpm 离心 5min,然后小心从上层取需要量,用 blocking solution 以 1:10000 的比例稀释。 eg.可取 1ul 稀释到 10ml。 直接检测方法估计探针标记效率: 直接检测方法估计探针标记效率: 一系列稀释度的 DIG 标记探针直接点在膜上,同时一系列已知稀释度的 DIG 标记的对 照探针也点在膜上,通过标准检测过程显示出来。(具体操作步骤见 Kit)

3. 酶切
植物总 DNA 的用量一般为 5-15 ?g (例如水稻约为 5ug, 兰花和烟草约为 12-15ug),选 用在目的基因内无切点或有单一切点的酶进行酶切。同时切质粒作为正对照,切未转基因的 植物材料的总 DNA 作为负对照。 1) 酶切体系(以 EcoR I 切为例):切 200ul 体系 总 DNA H2O buffer H EcoR I 37℃酶切过夜(8-12h)。 150ul (5-15ug) 22ul 20ul 8ul

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2) 取 2ul 电泳检测酶切结果。酶切完全的 DNA 应呈均匀 均匀的弥散状。(切记!!) 均匀 3) 酶切完全后加水,将体积补充到 600ul,加 600ul 24:1 的氯仿:异戊醇抽提,13,000 rpm 离 心 5 min,取上层水相。 4) 加入 1/25 体积 的 5M NaCl,2 倍体积无水乙醇,-20℃沉淀两小时以上(或者过夜)。 5) 13,000 rpm (最好 4℃)离心 10 min,70% 乙醇洗涤沉淀,抽干 抽干。 抽干 6) 用 30ul 水溶解沉淀。

4. 电泳、转膜 电泳、
试剂: 试剂:
溶液 3M NaAC, pH5.2 成分 NaAC 配方 49.218g NaAC + H2O→调节 pH 至 5.2 →定容到 200ml 2M NaOH NaOH 400ml H2O + 40g NaOH → 定 容 到 500ml 5M NaCl NaCl 400ml H2O +146.1g NaCl→ 加热助溶 → 定容到 500ml→ 灭菌 1M Tris-Cl, pH7.5 Tris, HCl 800ml H2O +121.1g Tris + 浓 HCl 65ml → 1M HCl 调 pH 至 7.5→ 定容到 1L → 灭菌(应使溶液冷至室温后,方可 最后调定 pH) 变性液 (Denaturation solution) 中和液 (Neutralization solution) 0.5M NaOH 1.5M NaCl 2M NaOH 5M NaCl H2 O 0.5M Tris-Cl, pH7.5 3M NaCl NaCl 1M Tris-Cl, pH7.5 H2 O 20×SSC 3M NaCl 0.3M 柠檬酸钠 pH7.0 1M HCl HCl 定容至 100ml 120ml 180ml 70.13g 200ml 400ml

800ml H2O +175.3g NaCl + 88.2g 柠檬 酸钠→ 用 NaOH 调 pH 至 7.0→ 定容 到 1L→ 灭菌 17.24ml 浓 HCl + 182.76ml H2O

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0.2M EDTA, pH8.0

EDTA

5.845g EDTA→用 NaOH 调 pH 至 8.0 → 定容到 100ml

50×TAE (Tris-乙酸)

Tris-碱 冰乙酸 EDTA

Tris-碱 冰乙酸 0.5M EDTA, pH8.0 H2 O 定容至

242g 57.1ml 100ml 1L

步骤: 步骤: 1) 用 30 ?l 水溶解酶切后沉淀的 DNA,65℃水浴保温 10min,立即放到冰上。 2) 冷却后上样品,走 0.8% 琼脂糖凝胶(进口琼脂糖),恒压 60V 电泳 3-4 小时,电泳槽 周围加冰。
样品 上样量 λDNA/HindIII Marker 35ng 质粒正对照 5ng 未转基因负对照 5-15ug 转基因材料 5-15ug

3) 溴酚兰距加样孔 6-8 cm 左右时停止电泳。切掉加样孔及多余的胶,切掉左下角作标记。 4)将凝胶浸入 200ml, 0.25 M HCl 中进行脱嘌呤处理约 5-10 min (若检测条带都小于 10kb, 可省此步) 。 5)将凝胶取出在去离子水中漂洗一下后,浸入变性液中, 2×15 min 6)将凝胶取出,在去离子水中漂洗一下,然后浸入中和液中, 2×15min。 7)将凝胶取出在去离子水中漂洗一下后,进行毛细转移。 8)DNA 的毛细转移:大培养皿中盛 20×SSC → 上架玻璃板→ 玻璃板上铺厚滤纸→ 赶气泡 → 将凝胶加样孔朝下放在滤纸桥上→ 周围用 Parafilm 膜盖住→ 胶上放等大的尼龙膜→ 赶气泡→ 膜上放四层与膜等大的滤纸→ 赶气泡→ 上放 10 cm 厚的纸巾→ 放玻璃板→ 上 压 500 g 重物。 9)毛细转移 24 h,取出膜在 2×SSC 中洗一下,夹于滤纸中,80℃烤膜 2 h。

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5. 杂交 杂交:
探针 DNA 使用浓度 25ng/ml 杂交液 标准杂交液 标准杂交液+50%甲酰胺 RNA 100ng/ml 标准杂交液+50%甲酰胺 杂交温度 68℃ 37-42℃ ℃ 50℃

试剂: 试剂:
溶液 DIG Easy Hyb (Kit) 成分/用途 杂交液 配方 将 64ml 灭菌 dd H2O 分两份小心加入 DIG Easy Hyb Granules(瓶 7),立 即在 37℃下搅拌约 5min 使其溶解。

10% SDS

SDS

80ml H2O + 10g SDS→ 加热助溶→ 定 容到 100ml(用 0.22um 孔径的滤膜过 滤除菌)

步骤: 步骤: 1)预杂交:将膜浸入预热到杂交温度的(65℃)DIG Easy Hyb 中(10ml /100cm2 膜),在 杂交箱中 65℃ ,60 rpm,预杂交至少 30min(可延长到 1h)。 2) 将 DNA 探针 探针(约 25ng/ml DIG Easy Hyb)在 100℃变性 5 min 后,立即放到冰上,冷却 2 min。 4) 将变性的 DNA 探针加到预热的(65℃)DIG Easy Hyb 中(3.5ml /100cm2 膜),轻柔混 匀,避免泡沫。 5) 倒掉预杂交液,将杂交液倒入杂交瓶中,65℃,60 rpm,杂交 12-16 小时。 6) 杂交结束,回收杂交液,-20℃可保存 1 年,再用时 68℃加热 10min 重新变性探针。

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6. 洗膜: 洗膜:
1)低严谨性(高盐,低温):充足的 2×SSC+0.1% SDS,室温 60 rpm 洗涤 2×5 min。 2)高严谨性(低盐,高温):0.5×SSC+0.1% SDS(预热到洗涤温度),60 rpm 洗涤 2× 15 min。 注:如果探针>150 bp 且 G/C% 较高,应当在 68℃洗膜;短于 100bp 时,洗涤温度同杂交温 ℃ 度。

7. 检测:应用化学发光检测法,所有操作都在室温进行 检测:
步骤: 步骤: 1)杂交结束并洗膜后,在 Washing buffer 中短暂冲洗膜约 1-5 min。 2)在 80ml Blocking solution 中封闭 30 min。(轻摇) 3)在 20ml Antibody solution 中反应 30 min。 4) 转移膜入新容器,用 Washing buffer 洗两次,每次 15min。 5)在 20ml Detection buffer 中平衡 2-5min。 6)将膜 DNA 面朝上小心放入杂交袋中,吸取 1ml CSPD ready-to-use(Kit 瓶 5)均匀应用 到膜上,立即将杂交袋的上层盖在膜上,使底物均匀布满膜表面,并且避免气泡产生。 室温反应 5min 。 7)挤出多余液体,将杂交袋的边缘封住。(防止膜干燥) 8)将膜放在 37℃ ,10 min ,以强化发光反应。 9)曝光 X-胶片 15-25min,观察结果。

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7. 检测:应用化学发光检测法,所有操作都在室温进行 检测:
试剂: 试剂:
溶液 1M 马来酸 成分 马来酸(maleic acid) 配方 400ml H2O +58.04g maleic acid→ 定容 到 500ml(65℃助溶) 马来酸 Buffer 0.1M maleic acid 0.15M NaCl pH7.5 (20℃) 1M maleic acid 5M NaCl H2O 100ml 30ml 870ml

用固体 NaOH 调 pH 至 7.5(要仔细, 易调过) Washing buffer 0.1M maleic acid 0.15M NaCl 0.3% (v/v) Tween 20 pH7.5 (20℃) 1M maleic acid 3M NaCl Tween 20 H2O 用固体 NaOH 调 pH 至 7.5 1M Tris-Cl, pH9.5 Tris, HCl 400ml H2O + 60.5g Tris → HCl ( 浓 HCl 约 3ml 左右)调 pH 至 9.5→ 定容 到 500ml→ 灭菌 Detection buffer 100mM Tris-Cl, pH9.5 100mM NaCl 1M Tris-Cl, pH9.5 5M NaCl H2O 3M NaCl NaCl 50ml 10ml 415ml 100ml 50ml 3ml 847ml

400ml H2O +87.65g NaCl→ 加热助溶 → 定容到 500ml→ 灭菌

Blocking solution(现用 现配) Antibody solution

10×Blocking solution(Kit 瓶 6) Anti-Digoxigenin-AP ( Kit 瓶 4)(75mU/ml) 1: 10000 稀 释

10×Blocking solution 马来酸 Buffer

10ml 90ml

将 Anti-Digoxigenin-AP 在 10000rpm 离 心 5 min , 从 表 面 吸 取 溶 液 。 2ul / 20ml Blocking solution

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