Southern Blot操作流程

Southern Blot 操作流程
1、 哺乳动物基因组 DNA 的提取 (或用 OMEGA 试剂盒 E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit) 1、 取约 30mg 样品,加入 600 ul SNET,再加入 12 ul(20.2mg/ml)的蛋白酶 K,使蛋白酶 K 的终浓度为 400ug/ml; 2、 55℃振荡过夜; 3、 加入 0.6 ul RNaseA,室温下孵育 10 min,后置于 65℃ 10 min; 4、 加入 300 ul Tris 饱和酚,288 ul 氯仿和 12 ul 异戊醇,室温下振荡 30 min; 5、 17,000 g 离心 5min,转移上层水相(600 ul)至一新的离心管; 6、 加入等体积(600 ul)的异丙醇沉淀 DNA,于 4℃下 13,250 g 离心 15 min; 7、 小心除去异丙醇,加入 1 ml 70%的乙醇。离心 5 min 后除去乙醇,室温下干 燥 15~20 min;
8、 加入 100 ul TE,使核酸沉淀溶解。

一、

酶切

1、 拷贝数的计算 哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对,按插入基因单拷贝计算如下:

Insertion

of DNA ?bp
9

?

3 . 0 ? 10 bp
2、 酶切体系

?

mass of plasmid 10 ? g

基因组 DNA 10*Buffer 酶(10U/ul) Total

10

ug

10 ul 10 ul 100 ul

3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应; 4、 对酶切产物进行纯化,用 30 ul TE 洗脱; 5、 制备 1%浓度的琼脂糖凝胶(不加 EB) ; 6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于 70℃放置 15 min,以除尽残留乙醇和消除

酶切后产生的粘性末端;
7、 电泳:1v/cm。

二、

转膜

1、 碱变性:把胶条转移到含碱变性液的器皿中,摇床处理 15 min;重复一次; 2、 中和:倒出器皿中的碱变性液,加入中和液,摇床处理 15 min;重复一次; 3、 倒出中和液,加入 20×SSC,摇床处理 15 min; 4、 转膜: 1) 在一干净的容器中放入一包吸水纸,倒入 20×SSC,浸湿; 2) 放上一张与胶条大小相当的 sigma 3M 滤纸,倒上一层 20×SSC,防止产生 气泡; 3) 将预先剪裁好的尼龙膜放入 ddH2O 中充分浸润 2 分钟; 4) 小心把胶条铺在滤纸上面,用玻璃棒擀平,赶走气泡; 5) 往胶上倒上一层 20×SSC,将尼龙膜铺在胶条上,再向上倒上一层 20×SSC; 6) 再放上一张与胶条大小相当的 sigma 3M 滤纸; 7) 用保鲜膜把胶条四周封上,在上面压上一包吸水纸,再用一个约 250mg 的物 体压在吸水纸上面; 8) 转膜过夜; 5、 固定 将膜放在用 10×SSC 浸湿的滤纸上面,使含 DNA 面朝上,放入紫外交联仪中, 以 1.5J,254n,2.5min 的程序将 DNA 固定在尼龙膜上。 三、 杂交

1、 标记探针:可用随机引物法或 PCR 方法标记探针; 2、 将尼龙膜有 DNA 的一面朝内,卷成筒状放入杂交管中,加入 10 ml 经预热 至 50℃的 DIG Easy Hyb,于 50℃ 预杂交 30 min; 3、 取 10 ul 经标记的探针,热水浴 5 min 变性,然后迅速放入冰水混合物中; 4、 将变性后的探针加入 4 ml 预热的 DIG Easy Hyb 中,混匀,并防止气泡的产 生(气泡会产生背景) ; 5、 倒出预杂交液,加入含探针的杂交液,杂交 4h 或过夜。 6、 杂交温度的计算

Tm=49.82+0.41(%G+C)-(600/I)[I=length of hybrid in base pairs] Topt= Tm-20 to 25℃ 四、 洗膜

1、 室温下用 W1 洗液洗 5min,重复一次; 2、 68℃下用 W2 洗液洗 15min,重复一次; 3、 将膜用 Washing Buffer 浸润 5min; 4、 25~50℃下,用 100ml Blocking Solution 孵育 30min,保持摇动; 5、 25~50℃下,用 20ml Antibody Solution 孵育 30min,保持摇动; 6、 用 100ml Washing Buffer 洗 15min,重复一次; 7、 用 20ml Detection Buffer 平衡 5min; 8、 将膜放入杂交袋中,使含 DNA 面朝上,滴加 1ml CSPD ready-to-use,将杂 交袋合上,并赶走气泡,于 15~25℃孵育 5min; 9、 挤出多余的液体,将潮湿的膜置于 37℃孵育 10min,以增强发光反应。 五、 显影 直接用成像系统成像。

DNA 提取的溶液配制
1.Tris-HCl (1mol/L ;PH 8.0)
用 800ml 蒸馏水溶解 12.1g Tris 碱,加浓 HCl(约 42ml)调 PH 至 8.0,应使 溶液冷却至室温后,方可最后调定 PH 值,加水定容至 1L。高压灭菌。 ***如果溶液出现黄色,应予以丢弃,并使用质量更好的 Tris。

2.EDTA(0.5 mol/L ;PH 8.0)
186.1 g EDTA·Na·2H2O 加入 800ml 水中,用 NaOH 调节 PH 至 8.0(约需 20gNaOH) ,定容至 1L,高压灭菌。 ***EDTA·Na 需在 PH 接近 8.0 时才会溶解。

3.NaCl (5 mol/L)
292g NaCl 加入 800ml 水中,定容至 1L,高压灭菌。

4.SDS(20%,m/v)十二烷基磺酸钠
200g SDS 加入 900ml 水中,加热到 68℃有助于溶解,定容至 1L。 ***无须灭菌,不要蒸汽高压。

5.SNET
20 mmol/L 5 mmol/L 400 mmol/L 1%(m/v) Tris-HCl(PH 8.0) EDTA(PH 8.0) NaCl SDS

6.TE(PH 8.0)
100 mmol/L 10 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0) EDTA(PH 8.0)

Southern 缓冲液配制(修正版) 1.Washing buffer:
分子量 0.1M 马来酸(116.07) : 0.15M NaCl (58.45) : 用 NaOH 调 pH 至 7.5 (20℃) 灭菌 0.3% Tween20: 3ml 15ml 1L 体系 11.607g 8.768g 5L 体系 58.035g 43.838g

2.Maleic acid buffer:
分子量 0.1M 马来酸(116.07) : 0.15M NaCl (58.45) : 用 NaOH 调 pH 至 7.5(20℃) 灭菌 1L 体系 11.607g 8.768g 5L 体系 58.035g 43.838g

3.Detection buffer:
分子量 0.1M TRIS Base(121.14) : 0.1M NaCl (58.45) : 1L 体系 12.114g 5.845g 灭菌 5L 体系 60.57g 29.225g

用 HCl 调 pH 至 9.5(20℃)

4. 10% SDS 1L 体系 SDS 溶液 100g SDS

用 0.45um 滤器进行灭菌(不能进行高温灭菌)

5. 20*SSC 分子量 3M NaCl (58.45) : 1L 体系 175.3g 88.2g

0.3M 柠檬酸钠(294.10) : 用 HCL 调 pH 至 7.0 灭菌

6.碱变性液 分子量 0.5M NaOH(40.0) 1.5M NaCl (58.45) 不需灭菌 1L 体系 20g 87.68g

7.中和液 分子量 0.5M Tris 1.5M Nacl 121.14 58.44 1L 体系 60.57g 87.66g


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