Southern blot实验报告

医学分子生物学实验技术 实验报告
实验名称: Southern blot

一、实验目的
1.学习核酸杂交的基本过程和操作。

二、实验原理
1. Southern blot 实验原理
根据 DNA 变性和复性发展的一种实验技术,就是分子杂交(hybridization)。指两条 来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下,根据碱基互补的原则缔结成双链分子。 Southern 杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶 DNA 片段进行杂交的技术,检测靶 DNA 片 段中是否存在与探针同源的序列。 其主要步骤包括: ⑴基因组 DNA 的限制性酶切; ⑵DNA 酶切片段的电泳分离和转移; ⑶杂交及检测。

三、实验步骤
1、基因组 DNA 的限制性内切酶酶切 1.1 按如下方案进行基因组的酶切

HL60 基因组 DNA 10 mg 10×Buffer E EcoR I(10 u/ml) ddH20 总体积 37℃保温 1.5 小时。

5 ul 2 ul 2 ul 11ul 20 ul

2、电泳分离
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2.1 保温期间,浇一块凝胶板:称 0.6g 琼脂糖加 60ml1xTAE,微波炉低火加热 1 分钟, 让琼脂糖完全溶解, 稍微冷却后, 加 6 ulGelRed, 浇在封好的并已插上梳子的凝胶板上, 移去气泡,室温放置 40 分钟以上。 2.2 DNA 酶切后加 1/5 体积 6x 加样缓冲液。 2.3 取阳性对照 10ul,含 c-myc 4.7 kb 线性片段 300pg,加 1/5 体积 6x 加样缓冲液。 2.4 取基因组 DNA10ug,加 ddH2O 至 10 ul,加 1/5 体积 6x 加样缓冲液。同时去自己抽 提的基因组 DNA20ul, 加 1/5 体积 6x 加样缓冲液。 2.5 将凝胶放入电泳槽中,加入 1xTAE,直到液面高出凝胶 1mm,将以上各样品小心加入 样品槽中,两组共用一块凝胶,共 7 个样,从左至右依次为:1 未酶切自己基因组,2 未酶切老师基因组,3 酶切老师基因组,4 阳性对照(4.8kb 线性 c-myc) ,5 酶切老师 基因组,6 未酶切老师基因组,7 未酶切自己基因组。 2.6 插上电源,负极在样品槽一边,DNA 将向阳极跑,100V 电泳 1 小时左右,直到溴酚 蓝染料跑到接近凝胶尾部,在电泳期间做好胶变性和转移准备。 2.7 紫外灯下观察和拍照。 3、变性 3.1 切胶,2-6 孔,宽 4.5cm,长 7cm(从顶部开始,可用尼龙膜保护纸作为标尺) 3.2 将凝胶浸在 5 倍体积约 300ml 的胶变性液中, 慢慢摇动 20 分钟。ddH2O 洗 2 次。 3.3 在胶中和液中慢慢摇动 15 分钟。 4、转移 4.1 在搪瓷盘中加入 300ml10×SSC,放上培养皿和小玻璃板 4.2 将 3 张长滤纸浸湿,逐张放在玻璃板上,用移液管的滚动,赶走气泡 4.3 切除多余凝胶,小心地将凝胶放在滤纸上,赶走滤纸与胶之间的气泡 4.4 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上, 同样不能有气泡, 然后放上三张浸湿的滤纸, 赶走气泡 4.5 紧贴凝胶四周各放一张 X 光片 4.6 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸,但不能让滤纸移动用刀片 在离滤纸周围约 1-2 mm 处,轻轻割断保鲜膜,但不能割破滤纸。 4.7 取走滤纸上的保鲜整齐地放上草纸, 数张草纸一折二, 草纸堆要高出搪瓷盘边约 10cm 在草纸上放上玻璃板, 压上约 500g 重的重物, 转移过夜 5、固定
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5.1 将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置 。 5.2 正面朝上放在紫外交联仪中,交联固定。 5.3 ddH2O 稍加漂洗后空气中自然干燥。 6、杂交和洗膜 6.1 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封闭 6 小时。 6.2 倒出预杂交液, 加杂交液 ,60℃杂交过夜。 6.3 回收杂交液 (可重复使用) ,将膜放在洗膜溶液 I(2xSSC,0.1%SDS)中, 室温洗 2 次, 每次摇动 5 分钟。 6.4 再在洗膜溶液 II(0.5xSSC, 0.1%SDS)中, 60℃洗 2 次, 每次摇动 15 分钟。 7、检测 7.1 将膜在缓冲液 1(马来酸缓冲液)中漂洗 3 分钟。 7.2 在缓冲液 2(封闭液)中室温摇动封闭 30 分钟。 7.3 在含 anti-DIG-AP 的抗体溶液中室温摇动,孵育 30 分钟。 (做密闭袋,先放膜,后 封边,再加入抗体溶液,以 1.0μl 加入 5ml 缓冲液 2 配成,最后封口) 7.4 用洗膜溶液 III(马来酸缓冲液,0.3%吐温)洗 2 次, 每次 15 分钟。 7.5 在缓冲液 3(检测缓冲液)中平衡 3 分钟。 7.6 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育 0.5-16 小时。 7.7 当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用 TE 或 ddH2O 洗去底物液, 拍照 并干燥保存。

四、实验结果
图 1 电泳 图 2 转膜染色

1 2

3

4

1

2

3

图 1:注:1 阳性对照,2 酶切老师样品,3 未酶切老师样品 图 2:注:1 阳性对照 2 酶切老师样品,3 未酶切老师样品
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由图 2 可知阳性对照出现转膜后染色阳性结果,酶切后老师样品 Southern 呈阴性,而 未酶切的样品呈现阳性条带。

五、实验注意事项
1. DNA 限制性酶的用量 1-5U/ugDNA, 时间为 1-20 小时。 中途可取少量 (小于十分之一) 电泳检测是否酶切完全。 2.内切酶一般保存在甘油中,甘油会抑制酶活性,因此,所加入酶的体积应小于反应 总体积的十分之一,否则应将反应体积加大。 3.标记探针在加入杂交液之前,一定要加热变性处理,并且要先在杂交液中混匀后加 入,不要直接加在膜上。最好在杂交袋中进行。 4.含有 DIG 标记探针的杂交液可以放在-20°C 保存,反复多次使用,每次用前在 60° C 热变性。 5.为了获得最佳效果,第一次使用的探针,可做系列模拟杂交,即将小块尼龙膜在不 同探针浓度的杂交液中杂交过夜,然后经显色检测,采用背景可以接受的最高的探针浓 度进行真实杂交。 6.第一次杂交的 DNA 可用碱去除探针(限于尼龙膜) ,用第二个探针做预杂交和杂交。 7。杂交实验的灵敏度取决于以下因素: 7.1 待检核酸分子的浓度和长度 浓度越大,复性速度越快,敏感性↑;分子越大,转膜越困难,敏感性↓; 转膜方法 7.2 探针的性质(标记效率、浓度,核酸性质) 对于单链探针,浓度越高,杂交率增加;探针标记方法和检测方法的选择 7.3 杂交液体积、温度和杂交时间 体积越小,杂交动力学越高;DNA/DNA 杂交适宜的复性温度为比 Tm 低 20~25℃;温度 ↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓ 7.4 杂交液的离子强度 低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+的作用),高浓度的盐使碱基 错配的杂交体更稳定 ,当进行序列不完全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较 高的盐浓度; 7.5 非特异性杂交反应:预杂交的作用 杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针的非特异吸附
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7.6 杂交后的漂洗:盐浓度、温度、次数,体积 漂洗从低严谨度→高严谨度 7.7 固相膜的选择 阳离子尼龙膜,对于尼龙膜可采用碱溶液转移,更有利于 DNA 的结合。

六、实验讨论
本实验凝胶电泳后,紫外灯下观察 2-4 条带均有 DNA 片段显示(2 酶切老师基因组,3 未酶切老师基因组,4 自己基因,而 1 号阳性对照组并没有明显的 DNA 条带出现,可能 是因为阳性对照的上样量很少有关,仅有 300pg。转膜结果中阳性对照组和老师未酶切 基因组有杂交后显色,而酶切后基因组并没有显色,原因很难解释,估计加样顺利弄烦 了,因为酶切后的基因组 DNA 片段更小,更有利进行杂交反应,因此更容易出现阳性结 果才能理解。 如果是实验上样顺序错误的话, 就证明本次 Southern blot 实验非常成功! 而没有被酶切的老师基因组没有出现条带的可能原因有: ①本实验采用毛细管法向上转 移,可能是由于转膜速度慢、效率低导致的转膜不完全,使 DNA 含量非常少,以至于无 法抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色; ②DNA 含量过少, 非放射性标记探针法灵敏度不 高,可以试用放射性探针标记法提高灵敏度;③预杂交液封闭非特异性结合位点时也结 合了含量很低的待测 DNA 位点,可以尝试用不同浓度的预杂交液来封闭非特异性位点; ④洗膜条件有:低严格度(低温、高盐) 、高严格度(高温、低盐) ,随着盐浓度增加, 杂交率增加(Na+的作用) ,高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,所以洗膜时一定要 按照低严格度→高严格度,可以减少 DNA 的流失。

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