Southern blot实验方法和操作步骤

Southern Blot 原理及实验方法 Southern Blot 原理及实验方法原理: 将待检测的 DNA 分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将 其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上, 固定后再与同位素或其它 标记物标记的 DNA 或 RNA 探针进行反应。 如果待检物中含有与探针互补的序列, 则二者通过 碱基互补的原理进行结合, 游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测, 从而显示 出待检的片段及其相对大小。 用途:检测样品中的 DNA 及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 试剂和器材 一、试剂 变性液:1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH。 中和液:0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5),1.5mol/L NaCl。 20×SSC:3mol/L NaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠。 以上溶液均在 100Kpa 灭菌 20 分钟。 2×SSC:用无菌移液管吸取 20×SSC 溶液 5mL,加无菌水 45mL。 6×SSC:用无菌移液管吸取 20×SSC 溶液 15mL,加无菌水 75mL。 二、器材 22cm×15cm 瓷盘 操作方法 1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离 DNA。取出凝胶,切去边缘多于部分,EB 染色,在紫外灯下照 相(放一标尺,可从像片中读出 DNA 迁移的距离)。 2. 将凝胶置于 200mL 变性液中,浸泡 45 分钟,并温和地不断振荡,使凝胶上的 ds-DNA 转 变为 ss-DNA,然后用重蒸水冲洗凝胶几次。 3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡 45 分钟, 将凝胶中和至中性。 防止凝胶的碱性破坏硝酸 纤维膜。 4. 取一个瓷盘,在底部放一块玻璃板(或一块海绵)使盛器内的 20 倍 SSC 转移滤液低于玻 板表面,在玻板表面盖一张 3mm 的二号滤纸,滤纸两边浸没于 20 倍 SSC 溶液中,在玻璃和 滤纸之间,赶掉所有的气泡。

5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上,赶走两层之间出现的气泡。 6. 裁剪一张硝酸纤维膜,其长与宽大于凝胶 1―2mm,并在角上作记号,以确定滤膜方位。 先把它放在去离子水中润湿后,再放在 20 倍 SSC 溶液中润湿 5 分钟,然后放在凝胶表面, 两层之间不可有气泡。 7. 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸,在 2 倍 SSC 溶液中浸湿,覆盖在硝酸纤维膜 上,同样要把气泡赶走。 8. 把一叠吸水纸(或卫生纸,约有 5―8cm 高,略小于滤纸),放置在滤纸上,在吸水纸上 再放一块玻璃板和重约 500g 的重物,放置过夜。 9.转移结束后,移去上面的吸水纸和滤纸,同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜,把凝胶的点样 与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。 11. 把已转移了 DNA 的硝酸纤维膜放在 6 倍 SSC 溶液中振荡浸泡 5 分钟, 然后放在滤纸上吸 干溶液。再把它夹在两层滤纸之间,80℃真空干燥 2 小时。 注意事项 (1)将凝胶中和至中性时,要测 pH, 防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。 (2) 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。 Southern 杂交简介: Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的 DNA 样品固定在固 相载体上, 与标记的核酸探针进行杂交, 在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂 交信号。通过 Southern 杂交可以判断被检测的 DNA 样品中是否有与探针同源的片段以及该 片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA 指纹分析和 PCR 产物判断等研究中。 但由于该技术的操作比较烦琐、 费时, 所以现在有一些其他的方法可以代替 Southern 杂交。 但该技术也有它的独特之处,是目前其他方法所不能替代的,如限制性酶切片段的多态性 (RFLP)的检测等。 一、基因组 DNA 的制备 二、基因组 DNA 的限制酶切 根据实验目的决定酶切 DNA 的量。一般 Southern 杂交每一个电泳通道需要 10-30μ g 的 DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的 10 倍浓度缓冲液,并可从该公司的产品目录 上查到最佳消化温度。为保证消化完全,一般用 2-4U 的酶消化 1μ g 的 DNA。消化的 DNA 浓度不宜太高,滤纸,以 0.5μ g /μ l 为好。由于内切酶是保存在 50%甘油内的,而酶只有 在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用,所以加入反应体系的酶体积不能超过 1/10。

具体操作如下:在 1.5ml 离心管中依次加入 DNA(1μ g /μ l) 20 μ g 10×酶切 buffer 4.0 μ l 限制性内切酶(10U/μ l) 5.0 μ l 加 ddH2O 至 50 μ l 在最适温度下消化 1-3hr。消化结束时可取 5μ l 电泳检测消化效果。如果消化效果不好, 可以延长消化时间,但超过 6hr 已没有必要。或者放大反应体积,或者补充酶再消化。如仍 不能奏效,可能的原因是 DNA 样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。 消化后的 DNA 加入 1/10 体积的 0.5M EDTA,以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯 仿抽提, 倍体积乙醇沉淀, 2.5 少量 TE 溶解 (参见 DNA 提取方法, 但离心转速要提高到 12000g, 以防止小片段 DNA 的丢失)。 如果需要两种酶消化 DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化;如果 反应条件不一致, 则先用需要低离子强度的酶消化, 然后补加盐类等物质调高反应体系的离 子强度,再加第二种酶进行消化。 三、基因组 DNA 消化产物的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法, 制备简单, 分离范围广 (200bp-50kb) , 实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的 DNA 片段范围。 表:不同浓度琼脂糖凝胶分离 DNA 片段的范围 琼脂糖凝胶浓度(%)分离 DNA 片段范围(kb) 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2

1. 制备 0.8%凝胶:一般用于 Southern 杂交的电泳胶取 0.8%。 2. 电泳: 电泳样品中加入 6×Loading 缓冲液, 混匀后上样, 留一或两泳道加 DNA Marker。 1-2V/cm,DNA 从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。取出 凝胶,紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。正常电泳图谱呈现 一连续的涂抹带, 照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置, 以确定被杂交的 DNA 长度。 四、DNA 从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 转移就是将琼脂糖凝胶中的 DNA 转移到硝酸纤维膜(NC 膜)或尼龙膜上,形成固相 DNA。 转移的目的是使固相 DNA 与液相的探针进行杂交。 常用的转移方法有盐桥法、 真空法和电转 移法。这里介绍经典的盐桥法(又称为毛细管法)。 (一)试剂准备 1.变性液:0.5M NaOH;1.5 M NaCl。 2.中和液:0.5M Tris-HCl(pH 7.4);1.5M NaCl; 3.转移液(20×SSC): NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠 82.2g,NaOH 调 pH 至 7.0,加 ddH2O 至 1000ml。 (二)操作步骤 1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中 30min。 2.中和:将凝胶转移到中和液 15min。 3.转移按凝胶的大小剪裁 NC 膜或尼龙膜并剪去一角作为标记,水浸湿后,浸入转移液中 5min。剪一张比膜稍宽的长条 Whatman 3mm 滤纸作为盐桥,再按凝胶的尺寸剪 3-5 张滤纸和 大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。(转移过程一般需要 8-24hr,每隔数 hr 换掉已经 湿掉的纸巾。转移液用 20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜 上沾染其他污物。) 4. 转移结束后取出 NC 膜,浸入 6×SSC 溶液数 min,洗去膜上沾染的凝胶颗粒,置于两张 滤纸之间,80°C 烘 2hr,然后将 NC 膜夹在两层滤纸间,保存于干燥处。 五、探针标记 进行 Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高, 棉纱,效果好;地高辛标记没有半衰期,安全性好。这里介绍放射性标记。 探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法,有一些试剂盒可供选择,操作也 很简单。

以下为 Promega 公司随机引物试剂盒提供的标记步骤: 1.取 25-50ng 模板 DNA 于 0.5ml 离心管中,100℃变性 5min,立即置冰浴。 2.在另一个 0.5ml 离心管中加入: Labeling 5×buffer 10μ l (含有随机引物) dNTPmix 2μ l (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM) BSA(小牛血清白蛋白) 2μ l [a-32P]dATP 3μ l Klenow 酶 5U 3.将变性模板 DNA 加入到上管中,加 ddH2O 至 50μ l,混匀。室温或 37℃ 1hr。 4.加 50μ l 终止缓冲液终止反应。 标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于 a-32P 的半衰期只有 14 天,所以标记 好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于 109 计数/分/μ l。 六、杂交 Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式,即探针为液相,被杂交 DNA 为固相。杂交发生 于一定条件的溶液(杂交液)中并需要一定的温度,可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的 在膜上流动。 杂交液可以自制或从公司购买, 不同的杂交液配方相差较大, 杂交温度也不同。 下面给出的为一杂交液配方: PEG 6000 10%;SDS 0.5%;6×SSC;50%甲酰胺。该杂交液的杂交温度为 42℃。 1.预杂交 NC 膜浸入 2×SSC 中 5min,在杂交瓶中加入杂交液(8cm×8 cm 的膜加 5ml 即可),将膜的 背面贴紧杂交瓶壁,正面朝向杂交液。放入 42℃杂交炉中,使杂交体系升到 42℃。取经超 声粉碎的鲑鱼精 DNA(已溶解在水或 TE 中)100℃加热变性 5min,迅速加到杂交瓶中,使其 浓度达到 100μ g/ml。 继续杂交 4hr。 鲑鱼精 DNA 的作用是封闭 NC 膜上没有 DNA 转移的位点, 降低杂交背景、提高杂交特异性。 2.杂交

倒出预杂交的杂交液,换入等量新的已升温至 42℃的杂交液,同样加入变性的鲑鱼精 DNA。 将探针 100℃加热 5min,使其变性,迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。 七、洗膜与检测 取出 NC 膜,在 2×SSC 溶液中漂洗 5min,然后按照下列条件洗膜: 2×SSC/0.1% SDS,42℃,10min; 1×SSC/0.1% SDS,42℃,10min; 0.5×SSC/0.1% SDS,42℃,10min; 0.2×SSC/0.1% SDS,56℃,10min; 0.1×SSC/0.1% SDS,56℃,10min。 在洗膜的过程中,不断振摇,不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明,当放射 强度指示数值较环境背景高 1-2 倍时, 是洗膜的终止点。 上述洗膜过程无论在哪一步达到终 点,都必须停止洗膜。洗完的膜浸入 2×SSC 中 2min,取出膜,用滤纸吸干膜表面的水份, 并用保鲜膜包裹,注意保鲜膜与 NC 膜之间不能有气泡。将膜正面向上,放入暗盒中(加双 侧增感屏),在暗室的红光下,贴覆两张 X 光片,每一片都用透明胶带固定,合上暗盒,置 -70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间,一般在 1-3 天时间。洗片时,先洗一 张 X 光片,若感光偏弱,则再多加两天曝光时间,再洗第二张片子。 影响 Southern 杂交实验的因素很多,主要有:DNA 纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移 效率、探针比活性和洗膜终止点等。 七、注意事项 1. 要取得好的转移和杂交效果,应根据 DNA 分子的大小,适当调整变性时间。对于分子量 较大的 DNA 片段(大于 15kb),可在变性前用 0.2M HCl 预处理 10min 使其脱嘌呤。 2. 转移用的 NC 膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透,否则会影响转膜效果;不可用手触摸 NC 膜,否则影响 DNA 的转移及与膜的结合。 3. 转移时, 凝胶的四周用 Parafilm 蜡膜封严, 防止在转移过程中产生短路, 影响转移效率, 同时注意 NC 膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡,以免影响转移。 4. 注意同位素的安全使用。 基因组 DNA Southern 杂交

1)基因组 DNA Southern 印迹的制备 预备 1.用适当的限制性内切酶消化基因组 DNA 样品(10μ g)。 2.进行琼脂糖凝胶电泳。一般用 0.7~1.0%的琼脂糖凝胶分离基因组 DNA,它在 1~15kb 的范围内有较好的分辨率, 可选用 TBE 或 TAE 缓冲液。 琼脂糖凝胶电泳需在 1V/cm 的电压下 进行,屏风,如果要分离片段大小相似的 DNA 带,应用较大的凝胶(20×25cm)。常用的标 准品是由 Hind Ⅲ消化的 λ DNA、Hae Ⅲ消化的 Φ X174 DNA 和 100 或 1000bp 的梯形图谱。 电泳完毕,将凝胶放在紫外透射仪上,并在凝胶旁放一尺子进行拍照。当把凝胶从盘内移动 紫外透射仪时,小心不要将凝胶滑落或弄破。 Southern 印迹的制备 1.将凝胶转移至塑料盒内。 2.加入至少 4 倍凝胶体积的 0.25mol/L HCl 使 DNA 脱嘌呤,置室温摇床温育 15min。这时 凝胶上样缓冲液中的溴酚蓝应变黄色,如果 15min 后仍呈蓝色,应再温育 5min。 3.小心地塑料盒内 HCl 弃去,用蒸馏水漂洗凝胶一次。 4.加入至少 4 倍体积的变性缓冲液,置室温摇床温育 20min。 5.用新鲜缓冲液重复步骤 4,小心弃去变性缓冲液,用蒸馏水稍加漂洗。 6.加入至少 4 倍体积的中和反应缓冲液,置室温摇床温育 15min。 7.用新鲜缓冲液重复步骤 6。 8.当处理凝胶时,裁一张略大于凝胶的滤膜(硝酸纤维膜或尼龙膜),预先用蒸馏水将滤 膜浸湿后用 20×SSC 浸泡至少 15min。 9.安装转移装置。在盘中加入印迹缓冲液(20×SSC),在缓冲液面作一平台,比如可倒置 一凝胶盘,上面盖三张经 20×SSC 饱和过的滤纸(Whatman 3MM),平台两侧的滤纸应浸泡 在缓冲液中,用 10ml 的玻璃吸管在其表面小心滚动以赶出所有气泡,并将滤纸推平。 10.倒数毫升 20×SSC 于滤纸表面,将凝胶面向下倒扣在滤纸上,小心赶出凝胶与滤纸间的 气泡,凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中(虹吸短路)。 11.加数 ml 20×SSC 浸没凝胶,表面覆以滤膜,确保凝胶与滤膜之间无气泡。 12.裁三张大小合适的 3MM 滤纸,用 20×SSC 浸湿后铺在滤膜表面。

13.放一叠干燥的吸水纸(印迹纸或纸巾)在 3MM 滤纸上(约 5~8cm 高)。 14.置一玻璃板于吸水纸上,其上放一重约 0.75~1kg 的物体。 15.DNA 转移可进行 12~16h(如过夜),确保槽内有足够的 20×SSC(1~3L)。 16.毛细管虹吸转移完毕,小心拆卸印迹装置。将膜与凝胶一起转移至干燥的滤纸上,凝胶 在上,用软铅笔标记凝胶和滤膜的加样孔位置,撕去凝胶。 17.用 5×SSC 漂洗杂交膜以去除琼脂糖残迹。 18.将滤膜放在一张干燥的 3MM 滤纸上稍微晾干。 19.固定 DNA 于滤膜上,若用硝酸纤维素膜,在 80℃真空箱中烤 2h;若用尼龙膜,将 DNA 面朝下暴露于紫外透射仪 3~5min。 20.这时的滤膜已可用于杂交,或贮存在 4℃。硝酸纤维素膜需真空保存,尼龙膜需用塑料 薄膜密封。 2)DNA 印迹杂交 1.用 5×SSPE 浸渗 DNA 滤膜。 2.将浸湿的 DNA 滤膜放入塑料袋内,袋的四边密封并剪去一角。 3.从缺口处加入预杂交液(0.1ml/cm2),避免加入气泡,将袋中的气泡全部挤出,封口。 4.将塑料袋置水浴摇床中温育,或夹在两块玻璃板中置 65℃烤箱 2~4 小时,确保滤膜表 面无气泡。 5.在 95℃ 10min 使探针变性,立即置冰浴冷却 5min。 6. 剪去杂交袋的一角, 将预杂交液倒入 15 或 50ml 的 Falcon 试管中, 将约 10~20ng/ml (随 机引物标记的)或 50~100ng/ml(缺口平移法的)探针加到预杂交液或新鲜配制的杂交缓 冲液中(如果打算用硫酸葡聚糖)。一般来说,106~107cpm/ml 已足够,轻轻混匀,用一 次性的塑料移液管将杂交液加到塑料袋内的滤膜上。 7.从开角处将杂交液袋内的气泡全部挤出,用纸巾吸去流出的少许杂交液,小心封口以防 杂交液漏出。必要的话,可将此杂交袋套在另一塑料袋中以防放射性污染。 8.在 65℃水浴摇床中温育或夹在两块玻璃板中置烤箱烘烤 12~16h。 9.杂交后,剪去杂交袋的一角,挤出杂交混合液倒入 15 或 50ml 的 Falcon 管中,小心不要 使放射性溶液溅出。

10. 将杂交袋完全打开, 用钝头镊子将滤膜转移至盘内以便漂洗, 立即用缓冲液 1 (2×SSC, 0.1%SDS)洗滤膜。 11.室温下,用漂洗缓冲液 1 漂洗滤膜三次,每次 5min。 12.室温下,用漂洗缓冲液 2(0.25×SSC,0.1%SDS)漂洗滤膜两次,每次 5min。 13.在 65℃用预热的漂洗缓冲液 2 洗膜 1~3 次,每次 15min。在更换缓冲液之间,应用盖 革计数器检测滞留在印迹中心的放射性 (将印迹中心所期望的特异性信号与印迹边缘所期望 的本底信号相比较)。 14.充分漂洗后,将滤膜放在一张 3MM 的滤纸上稍微晾干,将潮湿的滤膜封在薄塑料袋内或 用塑料薄膜包裹。 15.滤膜的放射自显影:将印迹膜(封在塑料袋内,DNA 面朝上)放在 X 射线暗盒底部,其 上放置(摄影的)胶片,增感屏常规贴在盒盖内面,关闭暗盒,在-70℃进行放射自显影过 夜~两周。


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